生体内で新生児マウスの造血細胞の移動の可能性を評価するためにコロンの細胞の Photolabeling
Summary
ここで説明されているプロトコルは、超腸サイトにコロンから移住免疫細胞を特定する新生児マウスの photolabeling アプローチを採用しています。この戦略は、初期の生活におけるホスト マイクロバイ相互作用の研究に有用になります。
Abstract
腸内細菌群集は、人生の早い段階で確立され、免疫細胞の発生と機能に影響を与えます。新生児の細菌は抗生物質の使用と自己免疫疾患および炎症性疾患への感受性に影響を与える食事を含む多数の外部の影響を受けやすいです。炎症性腸疾患 (IBD) などの疾患は、腸の免疫細胞の大量流入によって特徴付けられます。ただし、免疫細胞、細菌叢によって調節が超腸内サイトでの免疫反応に影響を与える腸から移住また。したがって、識別し、遠位のサイトに腸から微生物のメッセージを運ぶことができる細胞を分類する必要があります。ここでは、新生児マウス体内移行後余分な腸のサイトで彼らを識別するための大腸のラベル セルに手法について述べる。
Introduction
哺乳類の消化管では、ホスト1との共生関係にある細菌の種の数百を隠し持っています。ローカルの環境で現在の免疫細胞は、これらの微生物との共存を適用し、病原体の侵入に対する保護バリアを確立します。したがって、免疫細胞と微生物相の双方向相互作用は免疫系を教育し、病原体に免疫反応性のしきい値を設定します共生コミュニティを確立する重要です。免疫恒常性を乱す、1 型糖尿病、IBD の2,3などの免疫介在性疾患につながる消化管の炎症を抑制する規制の回路を混乱する微生物の組成、または dysbiosis、することができます変更.
期間中に腸内微生物群集は同時に免疫システムを確立し始めるユニークな発達ウィンドウ出産後すぐには、4を成熟します。生後の微生物叢は自然群集組成とよく5の変化と、安定しません。明確な解剖学的の場所に – 腸粘膜および腸の上皮6微生物叢と相互作用する免疫細胞が存在します。(これは樹状細胞、単球、マクロファージを含める) 骨髄細胞、リンパ球 (T 細胞、B 細胞、自然免疫リンパ球様細胞など) を含む腸の免疫細胞の様々 なタイプがあります。これらの細胞、造血細胞とも呼ばれる腸粘膜バリアーを維持し、恒常性を維持する機能の多数を実行します。
腸のサイトで彼らの規制機能に加え粘膜の免疫細胞はまた全身性免疫7,8,9を規制する超腸サイト宛ての微生物を運ぶかもしれない。成長の研究関心のある分野で、その機能を調査するために腸管組織から移行免疫細胞を特定する方法の必要性を強調します。ここで報告されるプロトコルは、ラベル セルの光変換蛍光蛋白質を利用市販マウス モデルを利用しています。ファム摘出マウスは遍在が不可逆的紫外線 (UV) 光10赤蛍光活性化に切り替えられる緑の蛍光 Dendra2 蛋白質を表現します。新生仔マウスの大腸に 405 nm の光を提供する繊維光学カニューレを用いて、脾臓の生まれか、コロンを通過 photoconverted 造血細胞を見つけることができますを示す.
Protocol
動物のすべてのプロシージャの承認機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) マサチューセッツ総合病院に準拠して行った。 注意: このプロトコルは、クラス 3 b レーザー (LG3) の使用を含みます。このレーザーを動作しているとき、LG3 レーザー安全ゴーグルを使用常にする必要があります。怪我のリスクを避けるために適切な訓練と安全のガイドラインに従わなければなり?…
Representative Results
光ファイバー ケーブルを使用して 2 日間の古いファム切除マウスのコロンに 405 nm の光を配信しました。前の実験で 30 秒露出は最小限の細胞毒性 (図 1A)、結腸細胞の最大光電を与えるに決定しました。したがって、コロンのさまざまなセグメントの連続 30 秒露出は、プロトコルに従って行われました。レーザ露光後マウス?…
Discussion
同定と対話し、大腸の微生物叢によって影響を受ける細胞の解析は重要であり、体の残りの部分に粘膜の微小環境からの情報を中継する方法を理解していただく必要があります。腸関連細胞遊走を勉強するための 1 つのメソッドには、その組織ホーミング パターンを決定し、12,13を機能する受信者のマウスに養子の転送が続いて腸関連細胞の分離?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ニーチャ ジャイナ教は、NIH/NIAID キャリア遷移賞 1K22AI116661-01 によって支えられました。
Materials
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| 기타 | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
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Cite This Article
Porter, C., Ennamorati, M., Jain, N. In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice. J. Vis. Exp. (138), e57929, doi:10.3791/57929 (2018).