Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität
Summary
Das hier beschriebene Protokoll basiert auf der genomweiten Quantifizierung der neugebildete mRNA von Hefezellen mit 4-Thiouracil beschriftet gereinigt. Diese Methode ermöglicht die Messung der mRNA-Synthese von mRNA Decay abgekoppelt und schafft somit eine genaue Messung der RNA-Polymerase II Transkription.
Abstract
Globale Mängel in der RNA-Polymerase II Transkription könnte durch transkriptomischen Studien analysieren stationären RNA überblickt werden. Der weltweite Rückgang der mRNA-Synthese ist in der Tat nachweislich durch eine gleichzeitige Abnahme der mRNA Abbau zu normalen stationären wiederherstellen kompensiert werden. Daher ist die genomweite Quantifizierung der mRNA-Synthese, unabhängig von mRNA Decay, die beste direkte Reflexion der RNA-Polymerase II transkriptionelle Aktivität. Hier diskutieren wir eine Methode verwenden, nicht störend metabolische Kennzeichnung der im Entstehen begriffenen RNAs in Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae). Insbesondere die Zellen sind für 6 min. mit einem Uracil analog, 4-Thiouracil kultiviert, und die beschrifteten neu transkribierten RNAs sind gereinigt und quantifiziert, um die Synthese von allen einzelnen mRNA zu bestimmen. Darüber hinaus mit Schizosaccharomyces Pombe Zellen beschriftet, als interner Standard ermöglicht Vergleich der mRNA-Synthese in verschiedenen S. Cerevisiae Stämme. Mithilfe dieses Protokolls und Anpassung der Daten mit einem dynamischen kinetischen Modell, können die entsprechende mRNA Decay Tarife ermittelt werden.
Introduction
Zellen reagieren auf endogene und exogene Signale durch die dynamische Veränderung ihrer Gen-Ausdruck-Programm. In den letzten Jahren ermöglicht eine enorme Entwicklung der genomweiten Methoden die genaue und umfassende Beschreibung der Transkriptom Änderungen unter verschiedenen Bedingungen. In den meisten transkriptomischen Studien Microarray-Hybridisierung oder Hochdurchsatz-Sequenzierung werden verwendet, um RNA Levels von einem gesamten stationären RNA Bruchteil zu quantifizieren. Transcriptional Änderungen unter einer bestimmten Störung können eine Vielzahl von Möglichkeiten, mit Veränderungen der spezifischen Genexpression oder ein großes Spektrum von Genen wird entweder auf- oder herunterreguliert anzeigen. Gen-Ausdrucks ergibt sich aus einem fein abgestimmten Gleichgewicht – oder stationären — zwischen RNS-Synthese von RNA-Polymerasen und andere Prozesse, die RNA-Ebene. RNA-Polymerase II Transkription, einschließlich seiner drei Phasen (Einleitung, Verlängerung und Kündigung) ist hoch und aufwendig mit mRNA Verarbeitung, zytoplasmatischen Export, Übersetzung und Abbau verbunden.
Mehrere neuere Studien gezeigt, dass mRNAs Synthese und Verfall gekoppelten Mechanismen und zeigte, dass transkriptionelle Effekte auf Mutation oder unter Reize bei der Quantifizierung der gesamten stationären RNA übersehen werden können. Erstens hängt die Erkennung von transcriptional Änderungen durch die Analysen der Steady-State Ebenen der mRNA immer mRNAs Halbwertszeit. Sobald die Störung eingeführt wird, werden die Steady-State Ebenen der mRNAs mit langen Halbwertszeiten viel weniger als die der mRNAs mit kurzen Halbwertszeiten betroffen sein. Daher ist die Nachweisbarkeit der Veränderungen in der RNS-Synthese stark zu Gunsten der kurzlebigen Transkripte, voreingenommen, während die Analyse der langlebigeren mRNA-Spezies Scheitern könnte, um dynamische Veränderungen der Transkription Rate zu offenbaren. Zweitens: mehrere Berichte haben gezeigt, dass sowohl in Hefe und Säugetiere, globale Veränderungen in der Transkription übersehen werden könnten, wenn die Steady-State Ebenen der mRNA zu analysieren. Dies ist wahrscheinlich auf die Mechanismen, die mRNA-Synthese und Degradation mRNA Pufferung zu verknüpfen. Dies veranlasste die Entwicklung neuer Protokolle, mRNA-Synthese, die losgelöst vom Abbau durch die Analyse der neu transkribierte mRNA zu quantifizieren. In den letzten Jahren wurden mehrere Alternativen vorgestellt, darunter globale Nachlauf Sequenzierung (GRO-Seq)1und native Dehnung Transkript Sequenzierung (NET-Seq)2,3. Hier präsentieren wir ein Protokoll zunächst in Säugerzellen4,5,6 entwickelt und dann an Hefe7,8,9,10, 11, basiert auf RNA, die Kennzeichnung mit einem Thiolated Nukleosid oder base Analog, 4-Thiouridine (4sU) oder 4-Thiouracil (4tU), beziehungsweise.
Diese Methode reinigt speziell neu transkribierten RNA aus den Zellen in die RNA mit 4sU mit praktisch keine Einmischung in die Zelle Homöostase Puls gekennzeichnet sind. Daher, sobald die Zellen 4sU ausgesetzt sind, ist das Molekül schnell Uptaken, um 4sU-Triphosphat phosphoryliert, und in RNA transkribiert wird. Sobald Puls-Label, es ist möglich, insgesamt zelluläre RNA (entsprechend Steady-State Ebenen der RNA) extrahieren und anschließend mit der Bezeichnung von 4sU RNA ist Thiol-speziell modifiziert, was zur Bildung einer Disulfid Bindung zwischen Biotin und die neu transkribierten RNA4,5. 4sU kann jedoch nur Uptaken durch die Zellen einen Nukleosid-Transporter, wie der menschliche equilibrative Nukleosid-Transporter (hENT1), verhindert den unmittelbaren Einsatz in Knospung oder Spaltung Hefe zum Ausdruck zu bringen. Während eines hENT1 in S. Pombe oder S. Cerevisiaeausdrücken könnte, kann ein einfacher Ansatz erreicht werden durch die modifizierte base 4tU da 4tU, ohne die Notwendigkeit des Ausdrucks eines Nukleosid-Transporter-10, Hefe-Zellen aufnehmen kann 11 , 12 , 13. In der Tat, der Stoffwechsel von 4tU erfordert die Aktivität des Enzyms Uracil-Phosphoribosyltransferase (UPRT). In einigen Organismen, einschließlich Hefe aber keine Säugetiere ist UPRT für eine Pyrimidine Salvage Pathway recycling Uracil, Uridin Monophosphate.
Eine wichtige Voreingenommenheit in transkriptomischen Studien kann durch die Normalisierung zwischen verschiedenen Proben analysiert parallel eingeführt werden. In der Tat können viele abweichende Faktoren beeinflussen die vergleichende Analyse des transkriptoms Mutanten und Wildtyp Stämme: die Effizienz der Zelle Lysis, Unterschiede in der Gewinnung und Verwertung von RNA und Abweichungen in der Scanner-Kalibrierung für Microarray Analysen , unter anderem. Wie oben besprochen, können solche Schwankungen besonders irreführend sein, wenn globale Auswirkungen auf RNA-Polymerase II Transkription zu erwarten sind. Eine eleganteste Mittel genau mRNA Synthese Preise zwischen verschiedenen Proben vergleichen wurde mithilfe der weitläufig verwandten Spalthefe Schizosaccharomyces Pombe als interner Standard entwickelt. Dafür eine feste Anzahl von S. Pombe beschriftet S. Cerevisiae Proben, Wildtyp oder mutierte Zellen vor der Zelle Lysis und RNA-Extraktion10Zellen hinzugefügt wird. Anschließend werden Steady-State und neugebildete RNAs von S. Pombe und S. Cerevisiae durch RT-qPCR oder über die Verwendung von Microarray-Chips oder Hochdurchsatz-Sequenzierung10quantifiziert. Zusammenführung dieser Daten mit kinetische Modellierung, können absolute Preise der mRNA-Synthese und des Verfalls in der angehenden Hefe gemessen werden.
Im Rahmen dieser Handschrift zeigen wir, wie die Analyse der neu transkribierten RNA erlaubt, um eine globale Rolle zu offenbaren, weil die Coactivator komplexe SAGA und TFIID RNA Polymerase II Transkription in angehende-14,15Hefe, 16. Wichtig ist, frühere Studien Steady-State mRNA-Niveaus in S. Cerevisiae quantifiziert und vorgeschlagen, dass SAGA spielt eine vorherrschende Funktion auf eine begrenzte Anzahl von Hefe Gene die stark betroffenen durch Mutationen im SAGA, aber relativ resistent gegenüber TFIID Mutationen,17,18,19. Überraschenderweise zeigten die SAGA enzymatischen Aktivitäten auf dem gesamten transkribierten Genom, was auf eine größere Rolle für diese Coaktivator in RNA Polymerase II Transkription handeln. Verminderte RNA Polymerase II Rekrutierung an am meisten exprimierten Genen wurde beobachtet, bei der Inaktivierung von SAGA oder TFIID, was darauf hindeutet, dass diese Koaktivatoren auf die meisten Gene zusammenarbeiten. Daher zeigte die Quantifizierung der neu transkribierte mRNA, SAGA und TFIID für die Transkription von fast allen Genen durch RNA-Polymerase II14,15,16erforderlich. Die Umsetzung der Kompensationsmechanismen entpuppt sich als eine Möglichkeit für die Zellen mit einem globalen Rückgang der mRNA-Synthese durch eine gleichzeitige weltweite Abnahme der mRNA Abbau gepuffert ist zu kämpfen. SAGA fügt in die Liste der Faktoren, die eine globale Auswirkung auf RNA Polymerase II Transkription, wie z. B. RNA Pol II Untereinheiten10, der Mediator Coactivator Komplex20, die allgemeine Transkription Faktor TFIIH21,22 , und indirekt, Elemente der mRNA Abbau Maschinen9,10,23. In SAGA Mutanten, Bilanzierung von bescheiden und begrenzte Änderungen im Steady-State mRNA-Niveaus trotz eines globalen und schweren Rückgangs der mRNA-Synthese-14wurden allgemein solche kompensatorische Ereignisse beobachtet. Ähnliche Untersuchungen wurden auch in einem BRE1 Löschung Stamm, was zu einem vollständigen Verlust des Histon H2B Ubiquitination durchgeführt. Interessanterweise konnte wesentlich milder, aber konsequente globale Auswirkungen auf RNA-Polymerase II Transkription nachgewiesen werden, bei fehlender Bre1, darauf hinweist, dass metabolische Kennzeichnung neu transkribierten RNA in Hefe erkennen und eine Vielzahl von Änderungen in mRNA zu quantifizieren Synthese-Preise.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während genomweite Tools, um Veränderungen in der Transkription zu analysieren noch zu verbessern sind, könnte die einzige Analyse des transkriptoms durch die Quantifizierung der Steady-State Ebenen der RNA nicht Änderungen in RNA Polymerase II Aktivität widerspiegeln. MRNA-Niveaus sind in der Tat nicht nur durch die RNA-Synthese, sondern auch durch ihre Reifung und Abbau geregelt. Zur Messung der mRNA-Synthese von mRNA Abbau abgekoppelt wurden unterschiedliche Protokolle in den letzten Jahren für die Analyse der i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Laszlo Tora für seine Unterstützung und V. Fisher, K. Schumacher und F. El Saafin für ihre Gespräche. T.B. wurde unterstützt durch ein Stipendium der Marie Curie-ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) und der Fondation Bogen. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der Agence Nationale De La Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2) unterstützt. Diese Studie wurde auch von ANR-10-LABX-0030-INRT, französische Staat von der Agence Nationale De La Recherche unter den Rahmen Programm Investissements Avenir ANR-10-IDEX-0002-02 verwalteten Fonds unterstützt.
Materials
| 4-Thiouracil | Sigma-Aldrich | Cat# 440736 | |
| Rapamycin | Euromedex | Cat# SYN-1185 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher | N/A | |
| RiboPure RNA Purification kit, yeast | ThermoFisher | Cat# AM1926 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | |
| EZ-Link HPDP Biotin | ThermoFisher | Cat# 21341 | |
| Thiolutin | Abcam | ab143556 | |
| µMACS Streptavidin kit | Miltenyi Biotec | Cat# 130-074-101 | |
| Transcriptor Reverse Transcriptase | Roche | 03 531 295 001 | |
| SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| GeneChip Yeast Genome 2.0 | ThermoFisher | 900555 | |
| GeneChip Fluidics Station 450 | ThermoFisher | 00-0079 | |
| GeneChip Scanner 3000 7G | ThermoFisher | 00-0210 |
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