שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II
Summary
הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על כימות ברמת הגנום של mRNA החדש מסונתז מטוהרים מתאי שמרים עם 4-thiouracil תוויות. שיטה זו מאפשרת למדוד את סינתזת mRNA חשיפות מהשחתה mRNA ומספק, לפיכך, מדידה מדויקת של RNA פולימראז II שעתוק.
Abstract
אולי אפשר להתעלם ליקויים גלובלית-RNA פולימראז II שעתוק על ידי מחקרים transcriptomic ניתוח מצב יציב RNA. אכן, הפחתת הגלובלית סינתזת mRNA הוכח פיצוי כספי על ידי ירידה בו זמנית ב- mRNA השפלה כדי לשחזר את רמות נורמליות של מצב יציב. ומכאן, כימות ברמת הגנום של סינתזת mRNA, באופן עצמאי מהשחתה mRNA, הוא הטוב ביותר השתקפות ישירה של RNA פולימראז II פעילות גנים ברמת השעתוק. כאן, אנו נדון שיטה באמצעות שאינם perturbing מטבולית תיוג של RNAs nascent ב האפייה (cerevisiae ס). באופן ספציפי, התאים מתורבתים במשך 6 דקות עם אורציל אנלוגי, 4-thiouracil, ואת RNAs לאחרונה משועתקים שכותרתו הם מטוהרים לכמת כדי לקבוע את קצבי סינתזת mRNA בודדות כל. יתר על כן, באמצעות תווית שמר הביקוע תאים כמו תקן פנימי מאפשר השוואת סינתזה mRNA שונה cerevisiae ס זנים. באמצעות פרוטוקול זה, הולם את הנתונים באמצעות מודל קינטי דינמי, יכול להיקבע mRNA הניוון המתאימים.
Introduction
התאים מגיבים רמזים אנדוגני, אקסוגני, דרך שינוי דינמי של התוכנית ביטוי גנים. בשנים האחרונות, התפתחות עצומה של הגנום כולו מתודולוגיות מאפשר תיאור מקיף ומדויק של transcriptome שינויים בתנאים שונים. במחקרים transcriptomic רוב, רצף הכלאה או תפוקה גבוהה microarray משמשים כדי לכמת את רמות ה-RNA מ שבריר הכולל של RNA מצב יציב. שינויים תעתיק תחת ההפרעות ספציפי באפשרותך להציג מגוון רחב של תוצאות אפשריות, עם שינויים בביטוי גנים ספציפיים או מגוון גדול של גנים להיות למעלה – או downregulated. ביטוי גנים הוא התוצאה של שיווי משקל מכויל — או מצב יציב – בין סינתזת RNA על ידי RNA polymerases ותהליכים אחרים המשפיעים על רמות ה-RNA. שעתוק rna פולימראז II, כולל שלושה שלבי ברורים שלה (חניכה, התארכות, סיום), קשורה מאוד, מסובכת mRNA עיבוד ייצוא cytoplasmic, תרגום, השפלה.
מספר מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי mRNAs סינתזה ודעיכה הם מנגנונים בשילוב והראו כי ניתן להתעלם תעתיק אפקטים על מוטציה או תחת גירויים בעת לכימות הכולל RNA מצב יציב. ראשית, הגילוי של שינויים גנים ברמת השעתוק דרך הבדיקות של רמות מצב יציב של mRNA תמיד תלוי mRNAs half-life. פעם אחת הוא הציג את ההפרעות, רמות מצב יציב mRNAs עם זמן מחצית החיים יושפעו הרבה פחות מאלה של mRNAs עם מחצית החיים הקצר. לכן, detectability של השינויים סינתזה RNA חריפה מוטה לטובת תעתיקים קצרת ימים, בזמן הניתוח של מינים mRNA longer-lived עשוי להיכשל לחשוף שינוי דינמי בקצב שעתוק. שנית, מספר דיווחים הראו כי, גם שמרים וגם יונקים, שינויים כלליים בתעתיק עשוי להיות להתעלם בעת ניתוח רמות מצב יציב של mRNA. . זה ככל הנראה בגלל המנגנון לקשר סינתזת mRNA והשפלה וכתוצאה מכך mRNA אגירה. זה הוביל לפיתוח של פרוטוקולים חדשים לכמת סינתזת mRNA חשיפות מן השפלה, דרך הניתוח של mRNA החדש משועתקים. בשנים האחרונות, מספר חלופות הוצגו, כולל ריצה הכללית רצף (GRO-seq)1ותעתיק מקורי התארכות רצף (NET-seq)2,3. כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול שפותחה לראשונה ב תאים בתרבית של4,5,6 ומותאמים ואז השמרים7,8,9,10, 11, אשר מבוסס על ה-RNA תיוג עם thiolated nucleoside או אנלוגי בסיס, 4-thiouridine (4sU) או 4-thiouracil (4tU), בהתאמה.
שיטה זו במיוחד מטהרת RNA משועתקים לאחרונה את התאים ב- RNA אשר נמצאים המסומנת הדופק 4sU עם כמעט ללא התערבות הומאוסטזיס תא. לכן, ברגע התאים נחשפים 4sU, המולקולה היא במהירות uptaken, phosphorylated אל 4sU-טריפוספט, שולבו RNAs עיבד. ברגע דופק עם התווית, זה אפשרי לחלץ סך RNA הסלולר (תואם לרמות מצב יציב של RNA), והיא, לאחר מכן, השבר RNA התווית על-ידי 4sU תיול-במיוחד משתנה, שמוביל להיווצרות קשר דיסולפידי בין ביוטין ו 4,לאחרונה משועתקים רנ א5. עם זאת, 4sU יכולה להיות רק uptaken על ידי התאים לבטא נהג nucleoside, כמו המשגר האנושי nucleoside equilibrative (hENT1), מניעת השימוש המיידי בו ניצני ביקוע או שמרים. בעוד אחד יכול להביע את hENT1 ס הביקוע או cerevisiae ס, גישה קלה יכולה להיות מושגת באמצעות 4tU את הבסיס שונה, שכן תאי שמרים עשויה להימשך עד 4tU, ללא הצורך של ביטוי של טרנספורטר nucleoside10, 11 , 12 , 13. למעשה, חילוף החומרים של 4tU דורש פעילות אנזים אורציל phosphoribosyltransferase (UPRT). מספר אורגניזמים, כולל שמרים אבל לא יונקים, UPRT הוא חיוני עבור מסלול הניצולת פירימידין, מיחזור אורציל כדי uridine monophosphate.
הטיה חשוב במחקרים transcriptomic יכול להיות הציג נירמול בין מדגמים שונים ניתח במקביל. אכן, גורמים deviating רבים יכולים להשפיע על ניתוח השוואתי של transcriptome של מוטציה וללחצים פראי-סוג: היעילות של פירוק התא, הבדלים החילוץ, שחזור של RNA וסטיות בתוך הסורק כיול עבור ניתוחים microarray , בין היתר. כפי שצוין לעיל, וריאציות כזה יכול להיות מטעה במיוחד כאשר צפויים אפקטים הכללית ב- RNA פולימראז II שעתוק. אומר אלגנטי להשוות במדויק mRNA מחירים סינתזה בין מדגמים שונים תוכנן על-ידי שימוש שמרים ביקוע קרובים רחוקים שמר הביקוע תקן פנימי. בשביל זה, מספר קבוע שכותרתו ס הביקוע תאים מתווסף הדגימות cerevisiae ס , או פראי-סוג או מוטציה בתאים, לפני פירוק התא ל- RNA החילוץ10. לאחר מכן, גם מצב יציב וגם לאחרונה מסונתז RNAs ס הביקוע , cerevisiae ס הם לכמת RT-qPCR או באמצעות שימוש microarray צ’יפס או רצף תפוקה גבוהה10. שילוב נתונים אלה עם מידול קינטי, שיעורי מוחלטת של סינתזת mRNA ודעיכה של ניצני שמרים ניתן למדוד.
במסגרת של כתב יד זה, נראה כיצד הניתוח של RNA לאחרונה משועתקים מותר לחשוף תפקיד גלובאלי עבור מתחמי coactivator SAGA, TFIID בתעתיק RNA פולימראז II בניצני שמרים14,15, 16. חשוב לציין, מחקרים שנעשו בעבר לכמת את רמות ה-mRNA מצב יציב cerevisiae ס והציע זה הסאגה ממלא פונקציה השולט על קבוצה מוגבלת של גנים שמרים אשר חריפה המושפעים על ידי מוטציות בסאגה, אבל יחסית עמידים בפני TFIID מוטציות17,18,19. באופן מפתיע, פעילויות אנזימטיות הסאגה הוצגו לפעול על הגנום כולו משועתקים, רומז תפקיד רחב יותר עבור activator זה שותף ב- RNA פולימראז II שעתוק. ירידה RNA פולימראז II גיוס-גנים ביטוי ביותר נצפתה על איון של הסאגה או TFIID, רומז כי אלה coactivators לעבוד ביחד-רוב הגנים. לפיכך, כימות של mRNA משועתקים לאחרונה חשף כי הסאגה, TFIID נדרשים עבור שעתוק של גנים כמעט כל RNA פולימראז II14,15,16. מימוש מנגנוני פיצוי מתגלה דרך עבור התאים להתמודד עם ירידה גלובלית סינתזת mRNA אשר נאגרת על ידי ירידה גלובלית סימולטני mRNA השפלה. הסאגה מוסיף לרשימה של גורמים שיש השפעה גלובלית על ה-RNA פולימראז II שעתוק, כגון ה-RNA Pol II subunits10, מתחם coactivator20את המתווך, הגנרל שעתוק מקדם TFIIH21,22 , בעקיפין, יסודות ה-mRNA השפלה מכונות9,10,23. הסאגה מוטציות, והיוו השינויים צנוע ומוגבל ברמות ה-mRNA מצב יציב למרות ירידה גלובלית וחמור סינתזת mRNA14אוניברסלית זו נצפתה אירועים כאלה הבולמוס. ניתוחים דומות בוצעו גם בזן מחיקה BRE1 , וכתוצאה מכך אובדן מוחלט של היסטון ויזת עבודה H2B ubiquitination. מעניין, הרבה מתון יותר אך עקבי הכללית השפעה על ה-RNA פולימראז II תמלול יכול להתגלות, בהעדר Bre1, המציין כי תיוג מטבולית של RNA משועתקים לאחרונה ב שמרים ניתן לזהות ולכמת מגוון רחב של שינויים ב- mRNA המחירים סינתזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד הגנום כולו כלים לנתח את השינויים בתעתיק עדיין מוכיחה, ניתוח הבלעדית של transcriptome באמצעות כימות של רמות מצב יציב של RNA אולי אינן משקפות במדויק את שינויים בפעילות השנייה של RNA פולימראז. אכן, רמות ה-mRNA מוסדרים לא רק על ידי סינתזה RNA, אלא גם על ידי שלהם התבגרות והשפלה. כדי למדוד את סינתזת mRNA חשי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לזלו תורה התמיכה שלו, נגד פישר, שומאכר ק ו פ Saafin El לדיונים שלהם. שחפת נתמכה על ידי מלגת מארי קירי-ITN (PITN-GA-2013-606806, נ-NET) ואת הקשת Fondation. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מ- סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). מחקר זה נתמך גם על ידי ANR-10-LABX-0030-INRT, קרן צרפתית המדינה ניהלה את סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש תחת d’Avenir Investissements תוכנית מסגרת ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| 4-Thiouracil | Sigma-Aldrich | Cat# 440736 | |
| Rapamycin | Euromedex | Cat# SYN-1185 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher | N/A | |
| RiboPure RNA Purification kit, yeast | ThermoFisher | Cat# AM1926 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | |
| EZ-Link HPDP Biotin | ThermoFisher | Cat# 21341 | |
| Thiolutin | Abcam | ab143556 | |
| µMACS Streptavidin kit | Miltenyi Biotec | Cat# 130-074-101 | |
| Transcriptor Reverse Transcriptase | Roche | 03 531 295 001 | |
| SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| GeneChip Yeast Genome 2.0 | ThermoFisher | 900555 | |
| GeneChip Fluidics Station 450 | ThermoFisher | 00-0079 | |
| GeneChip Scanner 3000 7G | ThermoFisher | 00-0210 |
References
- Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
- Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
- Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , 11-17 (2012).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
- Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
- Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
- Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
- Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
- Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
- Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
- Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).
- Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
- Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
- Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
- Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
- Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
- Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
- Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
- Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
- Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
- Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
- Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
- Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741 (2017).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
- Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
- Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822 (2013).
- Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
- Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
- Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
- Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
- Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
- Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
- Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
- Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
- Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).
