Summary
여기, 우리는 전기 신경 자극 기의 도움으로 회귀 후 두 신경에 근접에 있는 헌 근육 파생 된 줄기 세포를 주입 하는 프로토콜을 제시. 이 새로운 기술은 말 회귀 후 두 신경 병의 치료에 유용 될 수 있습니다.
Abstract
회귀 후 두 신경 (RLN)는 일반적으로 영향을 말 하 고 비정상적인 호흡 소리와 운동 옹 졸이 특징 이다. 회귀 후 두 신경 demyelination의 병 변을 보여줍니다. Demyelinated 신경 줄기 세포 적용의 장점은 다양 한 동물 모델에서 증명 되었습니다. 연구의 목표는 전기 신경 자극 기를 사용 하 여 건강 한 말에 타당성과 헌 근육 유래 중간 엽 줄기 세포의 왼쪽된 회귀 후 두 신경에 맞춰서 신경 주사의 안전 테스트를 했다.
근육에서 파생 된 줄기 세포 5 건강 Standardbred 말에서 삼 두 근 근육에서 반자동 14 G 생 검 바늘으로 근육 조직의 20 mg을 샘플링 하 여 얻을 수 있습니다. 후 두의 움직임은 모니터링 을 통해 위 기도 비디오 내 시경. 왼쪽된 회귀 후 두 신경 절연된 신경 차단 바늘 접근 이다. 신경 자극 적용, 2에서 시작 하는 엄마, 그리고 왼쪽된 arytenoid의 성공적인 납치 모니터링. 자극 강도 점진적으로 감소 하 고 있다. 모터 응답의 손실 0.5에서 관찰 되는 때 엄마, 107 헌 근육 파생 된 줄기 세포 주입. 시간 지점에 멀게 2 인의 시험관 치료 전에 주 1, 주 7, 그리고 세포의 주입 후 28 일에 말의 후 두 기능 점수. 6 말에 더 이상 바늘의 정확한 위치를 확인 하기 2 %lidocaine 1 mL 주입 됩니다. 이것은 왼쪽된 arytenoid 연골의 임시 마비.
이 연구는 회귀 후 두 신경 전기 신경 자극 기의 도움으로 접근 될 수 있다는 말에 의해 용납 신경의 전기 자극은 잘 증명을 한다. 후 두 기능의 수정 줄기 세포의 주입 후 말에서 관찰 되었다. 헌 근육 파생 된 중간 엽 줄기 세포의 말 RLN에서 고통에 맞춰서 신경 주사의 효과 설명 하기 위해 추가 연구를 실시 한다.
Introduction
RLN 말 arytenoid 마비의 다양 한 각도 의해 특징에 상부 기도의 일반적인 병리학 이다. 후 두의 왼쪽은 가장 일반적으로 영향을 받습니다. 질병의 유행은 특정 말 인구에서 35%까지 도달할 수 있다. 여러 가설 병이이 질병의 병 인을 설명 하 려, 하지만 RLN의 정확한 원인은 불확실 하다. 병 리는 병 변과 demyelination 그러나 remyelination도 어느 정도의 회귀 후 두 신경의 원심 axonopathy로 설명 되어 있습니다. 이 axonopathy는 본질적인 후 두 근육과 부수적인 위축1,2의 denervation에 지도 한다. 이 병리학 천천히 진보적인 종종 이며 영향을 받는 측면3arytenoid 납치의 총 손실을 발생할 수 있습니다.
영향을 받는 말 운동 중 비정상적인 호흡 소리를 방출 하 고, 때때로, 더 심한 경우에 운동 옹 졸을 표시. 최종 진단 후 두 납치의 부분 또는 전체 손실1,2,4관찰 비 진정 서 말에 내 시경 검사에 의해 이루어집니다. 현재, 가장 일반적인 치료는 때때로 ventriculo cordectomy와 관련 된 진료 (일컬어 "타이-다시"), 이다. 비록 이러한 수술의 전반적인 성공률은 우수한5좋은 것으로 간주, 수술 후 합병증은 매우 일반적 이다. 가장 일반적인 합병증 납치의 점차적인 손실 이다. 바 넷 외. 6 말의 76% 이상에서 수술 후 첫 6 주 이내 납치의 적어도 1 개의 급료의 손실을 보고 했다. 족 실패, 기침, 고 기도 오염, 등의 다른 합병증은 또한 보고5.
비록 그들의 효율성에 대 한 연구는 여전히 부족 한 입증 된 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 10 년 이상에 대 한 말 의학 연구와 실천의 일부를 되었습니다. 말에 성인 중간 엽 줄기 세포의 2 개의 가장 일반적으로 착취 소스는 골 수 및 지방 조직7입니다. 모두 샘플링 기법 상대적으로 침략 하 고 세포의 충분 한 수에 항상 지도 하지 않는다. 최근, Ceusters 외. 7 보다 적게 침략 적 microbiopsy 기술에 의해 얻은 굴리는 근육 조직에서 파생 된 줄기 세포의 문화를 설명 합니다.
MSCs 자기 갱신, 자동 생성, multipotency, 및 차별화7,8할 수 있다. 지방, 뼈, 근육, 연골의 모든 mesoderm 혈통으로 차별 하는 그들의 능력은 지금 잘 설립된9. 그러나, 특정 한 환경 조건에서 그들은 신경, 이다, 그리고 말 초 신 경계 및 척수9,10myelinating 세포와 같은 비 엽 혈통으로 차별화할 수 있습니다. MSCs는 여러 신경 모델10,11에서 이미 사용 되어 왔습니다. 그들의 능력과 퇴 화 신경 조직의 영역으로 이동 하는 신경 세포를 다시 생성 조직 및 지역 관리11후 증명 되었습니다. 또한, MSCs에서 파생 된 Schwann 같은 셀 수 세포 파편을 제거 하 여 neurotrophic 요인 axonal 성장 및 remyelination9분 비 세포를 모집 하 고 있다.
이 연구의 목적은 건강 한 말에 왼쪽된 회귀 후 두 신경 근처 근육 파생 헌 줄기 세포의 신경 자극을 유도 주사의 기술을 설명 하는 것입니다. 일반적으로, 주사 바늘에 연결 된 신경 자극 기 그 지역12에 현지 마 취약을 적용 하려면 주변 신경의 전기 지역화에 사용 됩니다. 약한 직류 전류는 모터 응답을 유도 하기 위해 신경에 근접에서 제공 됩니다. 이 모터 응답을 생성 하는 기능 몇 가지 매개 변수, 바늘의 전도성 지역, 조직, 현재 적용, 펄스 기간 및 신경에 바늘에서 거리의 어떤 임피던스에 따라 다릅니다. 신경 자극 기 바늘은 바늘의 나머지 부분을 절연 하는 동안, 바늘의 끝에 매우 제한적인 전도성 영역 하도록 설계 되었습니다. 이 디자인은 신경을 정확 하 게 지역화에 도움이 됩니다. 현대 신경 자극 다양 한 조직의 임피던스에 적응 하 고 지속적인 암페어는 컴퓨터에 설정을 제공 합니다. 또한, 대부분의 기계 사용 0.1의 펄스 기간 s, 그렇게 력이 매개 변수는 현재 적용 되 고 바늘 거리. 바늘을 신경 거리와 모터 응답을 생성 하기 위해 현재 필요한 관계의 쿨롱 법칙에 의해 설명: E = kQ/r; 여기서 E 필요한 자극 충전, k는 쿨롱의 상수, Q는 최소한의 필요한 자극 충전 이며 r은 두 전극 사이의 거리. 신경의 전기-지역화에서 두 전극 사이의 거리는 바늘을 신경 거리12간주 됩니다. 전기 충전 바늘 신경 거리13의 역 광장의 규칙에 따라 없어져 요. 임상 연습 모터 0.5 mA는 매우 성공적인 신경 블록에 상관에서 자극 신경 및 낮은 전류에서 모터 신호 손실 사고 intraneuronal 주사 관리에서 사용자를 방지할 것 이다 나타났습니다. 이 연구의 목적은 제한 된 수의 말에 안전과이 기법의 타당성을 테스트 하는. 타당성과이 기술의 안전을 확인 하는 경우 영향을 받는 말을 쉽게 전송할 수 있습니다. 또한, 말 RLN 주변 퇴행 성 신경 통에 대 한 모델이 될 수 있습니다.
Protocol
리 대학교의 동물의 윤리적 사용에 대 한 위원회 연구 프로토콜을 승인 했다.
1. 근육 Microbiopsy
- 육안 검사 및 촉진, 팔꿈치의 지점 및 어깨의 지점 사이 대략 중간 삼각 근 근육의 긴 머리에 샘플 사이트를 식별 합니다.
- 약 2 x 2 cm2 전기 깎기와 영역을 클립. 클리핑된 영역 1 분 polyiodide 액체 비누와 알코올 압축 구성 된 수술 스크럽을 적용 합니다. 중심에는 잘린 및 소독에 25g 바늘으로 2 %lidocaine 솔루션의 1 mL를 피하 주사.
- 항균 손 비누와 함께 손을 문질러. 멸 균 글러브에 넣어. 에 생 검 바늘과는 trocar를 멸 균 표면으로 일회용 살 균 드 레이프를 사용 합니다.
- 그림 1b 및 1 c에서 같이 스프링 메커니즘을 당겨 반자동 14 G 생 검 바늘을 팔. 그것의 기계 장치를 생 검 바늘을 놓습니다. 메 마른 표면에 무장된 생 검 바늘을 놓습니다. 정 및 그림 1는에서 같이 한 obturator 이루어져 trocar 익숙한 얻을.
그림 1 : 생 검 바늘 세트. 생 검 바늘 세트 구성 (a)는 정 맥 및 그것의 obturator 생 검 바늘 (위에서 아래로). 다른 패널 표시 생 검 바늘의 (b)에서 중립 하 고 (c) 무장 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 정 고는 obturator를 조립 하 여는 trocar를 준비 하 고 잠금된 위치에 그들을 유지. 이전 desensitized 존을 통해 피부에 수직으로 trocar를 소개 합니다. 어디는 trocar의 팁은 약 1.5 c m 위치에는 trocar를 미리 근육에 깊은. trocar를 꺼내, 해리는 obturator에서 정 하 고 메 마른 표면에는 obturator를 놓습니다.
- 정 맥을 통해 무장된 생 검 바늘을 소개 합니다. 바늘과 근육에 피부 절 개를 통해 정을 소개 합니다. 바늘의 팁 삼 두 근 근육의 긴 머리의 중간에 위치에 바늘을 사전.
- 생 검 바늘 놓고에 정 함께 생 검 바늘을 꺼내. 정에서 생 검 바늘을 당겨. 메 마른 표면에는 정을 남겨 주세요.
- 한 손으로 봄을 당겨 다른 누른 생 검 바늘을 엽니다.
참고: 표본 생 검 바늘의 끝에 표시 됩니다. - 두 번째 사람의 도움으로 샘플 매체를 포함 하는 샘플 튜브를 엽니다. 19 G 피하 주사를 사용 하 여 생 검 바늘에서 작은 근육 조각을 제거. 샘플링 중에 근육 샘플을 놓습니다. 나사 모자와 튜브를 닫고 부드럽게 기울기 샘플 매체에 떠 있도록 2 배.
- 생 검 바늘을 팔. 메 마른 표면에서 정 하 고 무장된 생 검 바늘과 캐 뉼 러를 재조 립. 무장된 바늘 및 앞에서 설명한 피부 절 개를 통해 정을 소개 합니다. 근육 조직의 약 20 mg을 샘플링 될 때까지 2-3 배 샘플 프로시저를 반복 합니다. 샘플링 튜브를 닫습니다. 부드럽게 튜브 2 차례 x 근육 조각 샘플링 매체와 함께 혼합.
- 4 ~ 8 ° c.에 사이 일정 한 온도에서 실험실에 샘플 발송
참고: 실험실 다음 샘플을 처리 합니다. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. - 절차는 잘 용납 하 고 샘플링 측면에 통증은 관찰 하지. 근육 통 샘플링 사이트에서의 경우, 적절 한 진통 치료를 관리 합니다.
2입니다. 셀의 처리
참고:이 연구에 사용 된 줄기 세포 Ceusters 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 방법에 따라 준비 된 7. 그들의 기사는 또한 세포의 특성을 설명 합니다.
- 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린 (1000 IU/mL)의 5 mL의 20%를 추가 하 여, DF20, 특정 문화 매체를 준비 하 여 시작-스 (10000 µ g/mL), 고 암포 b (250 µ g/mL)는 상용의 500 mL 한 병에 2.5 mL 글루타민과 페 놀 레드 문화 매체입니다.
- 24-멀티-잘 접시의 내부 16 우물의 각으로 DF20 문화 매체의 150 µ L를 붓는 다. 나머지 외부 우물에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) [염화 칼륨 (200 mg/L), 칼륨 인산 염 monophasic (200 mg/L), (8, 000 mg/L), 염화 나트륨 및 칼륨 인산 염 diphasic (2160 mg/L)]의 1 mL를 붓으십시오.
- 린스 작은 근육 조각 PBS에 2 배. 메스와 집게의 도움으로 매우 작은 조각으로 그들을 분리 및 멀티 잘 접시의 각 내부-16 (메스 칼 날의 팁의 크기)의 작은 조각 장소.
- 다음과 같은 조건에서 유지 하는 인큐베이터에서 다 잘 접시를 놓고: 37 ° C, 21% O2및 5% CO2. 거꾸로 현미경 매일 우물을 모니터링 하 고 밖으로 건조에서 세포를 방지 하기 위해 필요한 경우 DF20의 50 µ L를 추가.
참고: 약 10 일 후 있을 것입니다 충분 한 세포를 줄기 세포 격리 수 있도록 explant에서 성장. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. - Explants 셀의 후광 근육 주위 표시 됩니다 때, 근육 조직의 explant 삭제. 각 잘에서 EDTA를 포함 하는 트립 신 솔루션의 150 µ L를 사용 하 여 세포를 분리: 문화 매체를 폐기 1 mL의 PBS로 세포를 씻어, PBS, 삭제 하 고 37 ° c.에서 10 분의 최대 trypsin 솔루션 추가 중지는 trypsin의 행동, 세포 현 탁 액을 수확 하 고, 다음, 200 x g 37 ° c.에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심을 문화 매체 추가 삭제는 상쾌한 고 균형된 소금 솔루션에 펠 릿을 중단.
- 3 계층 (15%, 25%, 및 35%)의 불연속 밀도 그라데이션에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 원심 관 세포 현 탁 액 및 25 ° c.에 20 분 1250 x g 에서 불연속 밀도 그라데이션 솔루션을 포함 하 원심 분리기의 브레이크를 사용 하지 마십시오. 원심 분리 후 불연속 밀도 그라데이션 솔루션의 다른 레이어 사이 나타날 것 이다 다른 밀도와 셀 분수를 관찰 합니다.
- 15와 25% 사이 분수와 함께 문화를 계속 합니다. 튜브에 그것을 전송 하 고 균형 잡힌된 소금물으로 씻어. 200 x g 37 ° c.에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 폐기는 상쾌한. 계속 DF20의 1 mL에 펠 릿을 일시 중단 합니다. DF20의 6 mL와 함께 25 c m2의 표면을 가진 세포 배양 플라스 크, 프리 필. Prefilled 셀 문화 플라스 크로 셀을 전송 하 고 다음 조건으로 인큐베이터에 문화: 37 ° C, 21% O2및 5% CO2.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. - 세포는 거꾸로 한 현미경 아래 매일 모니터링 합니다. 필요한 경우 문화 매체를 변경 (오래 된 매체를 삭제 하 고 새로운 문화 매체의 6 mL을 추가). 문화 요리에서 셀 레이어 광학 현미경을 사용 하 여 미리 정의 된 배율에서 관찰 하 여 세포 합류를 결정 합니다. 셀에 의해 점유 되는 접시의 표면 예상. 모든 관찰 평가 합류 하 수에 대 한 고정된 현미경 배율에서 작동 합니다. 접시의 표면의 85%를 차지 하는 셀, 셀의 통과 함께 진행.
- 셀 confluent 때 2.4 단계에서 설명한 대로 동일한 프로토콜 EDTA를 포함 하는 트립 신 솔루션을 사용 하 여 분리 합니다. 그런 다음 200 x g 37 ° c.에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 상쾌한 삭제 하 고 셀에 DF20의 5 mL의 물의 resuspension 진행. DF20의 25 mL와 prefilled 175 cm2 의 셀 문화 플라스 크에 넣어. 다음과 같은 조건으로 인큐베이터에 플라스 크를 배치: 37 ° C, 21% O2및 5% CO2.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. - 세포는 거꾸로 한 현미경 아래 매일 모니터링 합니다. 필요한 경우 매체를 변경 (오래 된 매체를 삭제 하 고 새로운 매체의 30 mL을 추가). 셀 confluent 때 2.4 단계에서 설명한 대로 트립 신-EDTA를 사용 하 여 그들을 분리 합니다. 그런 다음 200 x g 37 ° c.에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 삭제는 상쾌한 고 6 ml DF20의 세포를 중단. 6 175 cm2 플라스 크에 세포 현 탁 액의 장소 1 mL, 각각 prefilled DF20의 25 mL로 하 고 37 ° c (21% O2 , 5% CO2)와 함께 공동2 인큐베이터에서 문화.
- 세포는 거꾸로 한 현미경 아래 매일 모니터링 합니다. 필요한 경우 매체를 변경 (오래 된 매체를 삭제 하 고 각 플라스 크에 새로운 매체의 30 mL을 추가). 셀 confluent 때 2.5 단계에서 설명한 대로 트립 신-EDTA를 사용 하 여 그들을 분리 합니다. 그들 원심 200 x g 37 ° C에서 삭제 각 단계에서 상쾌한 10 분 동안에 3 배.
- Bürker 챔버 및 가벼운 현미경의 도움으로 셀을 계산 합니다. 특정 cryopreservation 매체의 10 백만 셀/mL의 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
- Cryopreservation 매체의 1 mL에 1 x 107 셀의 치료 복용량에 deep-freeze와 그들의 사용까지 액체 질소의 증기 단계에서 그들을 저장 합니다.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. - 최종 사용에 대 한 드라이 아이스에 유리병에 셀 배.
3입니다. 세포의 주입
참고: 두 사람이 줄기 세포의 주입을 수행 해야 합니다.
- 따뜻한 실내 온도를 점차적으로 세포 현 탁 액. 현 탁 액 2 mL 주사기로 발음.
- 19 G 피하 주사 바늘으로 경 정 맥으로 detomidine 10 µ g/kg을 주입 하 여 말을 진정. 말의 특성 머리 아래로 위치에 의해 표시 되는 진정의 완전 한 효과 볼 수 5 분 기다립니다.
- 그림 2와 같이 20 x 10 c m2 의 영역을 깎기로 말의 왼쪽된 후 두 지역에 클립. 다음, 클리핑된 영역에 polyiodide 비누와 알코올의 수술 스크럽을 적용 합니다.
- 말의 왼쪽된 콧구멍을 통해 유연한 표준 비디오 내 시경 놓고는 nasopharynx 전진 합니다. Arytenoid 연골과는 후두개의 전체 보기를 얻을 때까지 내 시경의 위치를 조정 합니다. 내 시경이이 위치에 절차 동안 누른 연산자를 향해 비디오 내 시경 화면을 설정 합니다.
- 신경 자극 기의 부정적인 전극에 자극/주입 바늘을 연결 합니다. 바늘의 멸 균 상태를 유지 합니다. 신경 자극 기의 긍정적인 전극 잘린된 피부 영역에 붙어 전극 패치를 연결 합니다.
- 주입 라인에 세포 현 탁 액을 포함 하는 주사기를 연결 하 고 시스템의 공기를 튜브 프리 필. 시스템의 볼륨을 기억 하 고 살 균 염 분 솔루션의 같은 볼륨으로 주사기를 준비.
- 경우이 기술은 익숙하지 않은, 소독된 5 ~ 7 MHz 선형 초음파 변환기를 사용 하 여 관심 영역에서 해 부 구조를 시각화. 살 균 초음파 젤 커플링을 사용 하 여 이미지 품질을 증가. 후 두 및 후 두의 등 쪽 지역에서 실행 되는 혈관을 시각화.
- 일단 익숙한 지역의 해부학, 후 두의 dorsolateral 부분으로 자극/주입 바늘을 소개 합니다. 후 두의 dorsolateral 부분에 접근, 신경 자극 기 2의 전류로 1 Hz 자극 모드에서 시작 mA.
- 화면에 내 시경 보기를 관찰 하는 동안 바늘 회귀 후 두 신경의 위치 쪽으로 부드럽게 이동 합니다. 최대한 빨리 왼쪽된 arytenoid 연골의 납치 운동 비디오 화면에 표시 됩니다, 운동 장소에 바늘을 유지 하면서 사라질 때까지 전류를 줄일.
- 바늘의 이상적인 위치를 식별 합니다. 0.5에서 모터 응답의 손실을 고려 신경에서 이상적인 거리로 mA. Arytenoid 연골 움직임 0.4 보다 낮은 전류에서 계속 하는 때 mA, 하지 셀, 그는 intraneuronal 주입 될 수 있습니다 주사 할.
- 0.5 mA, 관찰에 모터 응답의 손실 107 자가 줄기 세포를 포함 하는 세포 현 탁 액을 주입 하 고 소금물 준비와 주입 라인을 플러시에서 3.6 단계. 이 주입 튜브에 세포 현 탁 액의 나머지를 삽입할 것입니다.
- 세포의 주입 후 꺼내 바늘 및 내 시경.
- 진정에서 복구 하는 말을 하자. 생 검 사이트 아니 더 이상의 치료가 필요 합니다.
Representative Results
리 대학교의 동물의 윤리적 사용에 대 한 위원회 연구 프로토콜을 승인 했다. 몽-르-Soie 말 연구 센터에서 연구 말의 무리에서 6 말이이 연구에 포함 됐다. 첫 번째 말에서 회귀 후 두 신경 통해에 의해 지역화 되었습니다. 그림 2 에서는 후 두 신경 자극에 말의의 왼쪽된 dorsolateral 부분에 삽입 자극 바늘 사용 설정 합니다. 운동의 arytenoid 연골의 손실을 0.5에서 관찰 되는 때 mA, 2 %lidocaine 1 mL 주입. 이 높은 전류에서 이동의 부재와 왼쪽된 arytenoid의 일시적인 마비 귀착되는. 컨트롤 내 시경 검사, 24 시간 후, arytenoid 기능의 완전 한 회복을 계시 했다. 전체 프로토콜 성공적으로 5 말에 반복 되었다. 말의 근육 microbiopsy에 부정적인 반응을 보였다. 모든 말에 세포의 충분 한 수는 설정된 된 시간에서 성장 했다. 상부 기도 내 시경 로빈슨 외 에 따라 모든 5 마리와 나 II.1의 후 두 기능 점수에서 수행 되었다 14 결정 했다. 모든 말은 아주 잘 회귀 후 두 신경의 신경 자극을 용납. 아니 부작용 자극 또는 줄기 세포의 주입 후에 관찰 되었다.
모든 endoscopies 기록 하 고 두 눈을 멀게 임상 득점 했다. Wilcoxon 순위 분석15테스트 후 두 기능의 사전 주입 점수 및 줄기 세포 주입 후 1, 7, 28 일에 얻은 점수 사이 차이가 없었다. 표 1 요약 arytenoid 운동 자극 전류 및 줄기 세포의 주입에 바늘의 삽입에서 시간 뿐만 아니라 다른 시간 지점에서 모든 말의 후 두 점수 때 세포 주입 하는 곳.
현재 연구에 사용 된 세포에 따라 준비 했다 프로토콜 게시 이전7. 모든 분수에서 셀 고 수 있었다 trilineage 차별화를, CD90 및 CD44, CD45와 MHC II를 표현 하지 않았다 clonogenic 용량을 했다. 15-25% 분수의 세포 그들은 보여주 CD90 및 가장 큰 증식 능력의 최고의 표현 때문에 추가 처리를 위해 선택 되었습니다.
현재 연구의 목표는 하지 줄기 세포 응용 프로그램이 손상 된 말 초 신경 재생을 하지만 절차의 타당성을 테스트에에 있는 작은 회귀 후 두 신경에 줄기 세포 주입의 안전 평가의 효율성을 테스트 했다 l 건강 한 말의 수입니다. 5에서 내 시경 이미징에 기능 변경의 부재 말 주사 후 최대 28 일 및 4 5의 모든 임상 증상의 부재 목마 주사 타당성 및 절차의 안전 확인 후 최대 1 년. 한 말 연구에 비관련 이유를 위한 후속 기간에 안락사를 했다. 기술을 말의 작은 수에서 안전 증명, 비록 현재 연구에 포함 된 말의 수는 희귀 이벤트의 부재를 설명 하기 위해 너무 낮은.
| 주입 하기 전에 점수 | 주입 (분)을 시간 | 전류 주입 (mA)에서 | 하루 1 게시물 주사 점수 | 하루 7 포스트 주입에 점수 | 하루 28 포스트 주입에 점수 | |
| 말 1 (Standardbred, 마 레, 16 세) | II.1 | 12 | 0.5 | 난 | II.1 | II.1 |
| 말 2 (Standardbred, 마 레, 22 세) | 난 | 3 | 0.7 | 난 | 난 | 난 |
| 말 3 (Standardbred, 마 레, 11 세) | II.1 | 4 | 0.5 | II.2 | II.1 | II.1 |
| 말 4 (Standardbred, 마 레, 12 세) | 난 | 7 | 0.5 | 난 | II.1 | 난 |
| 말 5 (Standardbred, 마 레, 10 세) | 난 | 3 | 0.7 | II.1 | 난 |
표 1: Signalment laryngeal 기능 점수는 말. 이 표에서 주입, 낮은 전류 주입, 그리고 전과 5 건강 한 말의 후 두 점수 1, 7, 및 주입 후 28 일 헌 근육 유래 중간 엽 줄기 세포에의 하기 전에 모든 arytenoid 운동 자극의 시간 왼쪽된 후 두 재발 신경에 근접입니다. 말 #5 하루에 28 주입 후 이유로이 연구에 관련이 없는 컨트롤 사용할 수 있었습니다. 로빈슨 외. 에 의해 설명 된 점수를 점수 참조 14. 여기, 내가 두 arytenoid 연골의 움직임 했다 동기 및 대칭, 고 두 arytenoid 연골의 완전 한 납치를 얻을 수 있고 유지 점수. 점수 II.1 의미 arytenoid 연골의 움직임은 비동기 또는 특정 시간;에 비대칭 수 있습니다 그러나, 두 arytenoid 연골의 완전 한 납치 획득 하 고 유지 될 수 있습니다.
그림 2 : 줄기 세포의 주입 중 설정. 신경 자극 바늘은 후 두의 왼쪽에 소개 되 고 왼쪽된 회귀 후 두 신경으로 지시. 신경 자극 기 0.8에서 설정 된 mA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 프로토콜에서는 신경 자극 기반 접근 방식을 사용 하는 말에 회귀 후 두 신경 근육 파생 된 자가 줄기 세포의 성공적인 응용 프로그램을 설명 합니다. 주변 신경에 근접에 있는이 세포의 주입은 원래 근육 microbiopsy 견본으로 절연, 문화, 및 줄기 세포의 특성의 수확 전에 자세하게 설명 되어 있다. 전기 신경 자극과 신경의 전기 지역화 현재 연구를 위한 봉사 했다 고 회귀 후 두 신경에 직접적인 근접에서 중간 엽 줄기 세포를 주입 하는 데 사용 되었다. 모터 응답은 nasopharynx 통해 비디오 내 시경에 의해 감시 되었다. 바늘의 위치 과정, 다른 신경 자극 했다, 하는 경우 해당 운동 내 시경 화면에 표시 했다. 회귀 후 두 신경의 성공적인 자극 arytenoid 연골의 전형적인 납치 특징 이었다. 한 말, 현지 마 취 arytenoid 근육의 일시적인 마비를 유도 하 주입 했다. 신경에 근접에 있는 세포의 성공적인 이식 현재 연구에서 특히 테스트 되지 않았습니다, 비록 전기-지역화는 신경 및 낮은 전류에서 주입의 줄기 세포는 신경 근처 적용 된 입증 했다. 신경에는 injectate의 근접 추가 로컬 마 취의 주사에 의해 유도 된 성공적인 모터 블록에 의해 입증 되었다.
나머지 5 마리에서 12 분에 3에서 다양 한 성공적인 줄기 세포 주입 될 때까지 첫 번째 자극에서 시간 말 했다 약간 진정 절차 동안, 그들의 준수 한 전기 자극을 증가. 말의 아무도 언제 든 지 불리 한 반응을 보였다 자극의 기간을 나타내는 수 수 연장 좋은 바늘 위치를 얻기 위해 필요한 경우. 가파른 학습 곡선 경우 연산자는이 기술을 사용 하 여이 정기적으로 및 말의 많은 수에 다양 한 해부학와 관찰 될 것으로 예상 된다.
말은 일반적으로 비정상적인 호흡 소리를 선도 왼쪽된 arytenoid 연골의 마비의 다양 한 각도가 특징 이다 RLN에서 고통을 하 고 운동 옹 졸. 영향을 받는 신경의 조직학 밝혀 주변 신경 병16의 전형적인 병 변. 주변 신경 병은 말 초 신경 병 변 장애인된 감각, 움직임, 또는 장기 기능에 이르는 다양 한 종류를 설명 하는 데 사용 하는 용어. 원인은 매우 다양 하 고 당뇨병, 영양 결핍, 특정 약물으로 치료, 외상 성 부상, 허 혈, 또는 감염, 포함 될 수 있습니다 또는 그들이 idiopathic 될 수 있습니다. 원인에 관계 없이, 주변 neuropathies Wallerian 퇴보, 원심 axonopathy, 또는 단편 demyelination 같은 일반적인 histopathological 신호를 공유합니다. 그것은 보였다 중간 엽 줄기 세포 주변 신경 손상된의 관리; 그들의 재생에 대 한 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 근본적인 메커니즘 잘 이해 되지 않는다. 전통적으로, 우리는 생각 중간 엽 줄기 세포 지방, 근육, 연골, 뼈 조직의 창시자로 차별화만 하지만 특정 조건 하에서 그들은 보였다 myocytes17, 이다18으로 차별화 하는 , 및 myelinating 세포 주변19 와 중앙 신 경계19의. 생체 외에서 문화 중 neuropeptides에 노출 신경 마커21,22를 표현 하는 세포로 중간 엽 줄기 세포의 분화를 부탁 합니다. 몇몇 vivo에서 학문은 신경 재생 및 좌 골 신경 상해10,23의 쥐 모델에서 기능 복구에 중간 엽 줄기 세포의 유익한 효과 설명 했다. 이것은 아마 조직-특정 셀24로 줄기 세포의 분화에 기여 하는 유리한 환경 조건에 의해 발생 합니다. 미래 연구 또한 RLN 영향을 말에 미리 차별화 된 셀의 관리에 대 한이 기법을 조사 해야 합니다.
우리의 지식 최선을이 그것으로 특정 치료를 주입 하기 위해 주변 신경을 지역화 하는 신경 자극의 사용을 설명 하는 첫 번째 보고서 이다. Neuropathic 고통 등 다양 한 종에서 다른 주변 신경 병 리 신경25,26에 근접에서 줄기 세포의 관리에 의해 치료 될 수 있습니다. 미래 연구는 임상 환자에 있는이 기술의 효과 테스트 하 고 마이그레이션 위험과 주입 된 세포의 분화의 가능성을 조사 해야 합니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
몽-르-Soie 말 연구 센터에 의해 연구 자금 되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
| Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
| TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
| TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG - 14090C | |
| Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
| DMEM - F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
| Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
| Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
| 24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
| Trypsin | Life technologies | 12604 | |
| HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
| NaCl | Sigma | S8776 | |
| T-25 cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
| T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
| Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |
References
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