Summary

Uma sonda de força direta para medir a integração mecânica entre o núcleo e o citoesqueleto

Published: July 29, 2018
doi:

Summary

Neste protocolo, descrevemos um método de micropipeta para aplicar directamente uma força controlada para o núcleo de uma célula viva. Este ensaio permite interrogatório das propriedades mecânicas nucleares na célula viva, aderente.

Abstract

As propriedades mecânicas do núcleo determinam sua resposta às forças mecânicas geradas nas células. Porque o núcleo é molecularmente contínuo com o citoesqueleto, métodos são necessários para sondar seu comportamento mecânico em células aderentes. Aqui, vamos discutir a sonda de força direta (DFP) como uma ferramenta para aplicar a força diretamente para o núcleo em uma célula aderente viva. Atribuímos uma micropipeta estreita à superfície nuclear com sucção. A micropipeta é traduzida longe do núcleo, o que faz com que o núcleo se deforma e traduzir. Quando a força restauradora é igual à força de sucção, o núcleo desconecta e elasticamente, relaxa. Porque o pressão de sucção é precisamente conhecido, é conhecida a força na superfície nuclear. Este método revelou-se que as forças de nano-escala são suficientes para deformar-se e traduzir o núcleo nas células aderentes e identificaram elementos do citoesqueleto que permitem que o núcleo resistir às forças. O DFP pode ser usado para dissecar as contribuições dos componentes celulares e nucleares para propriedades mecânicas nucleares em células vivas.

Introduction

Patologias como câncer envolvem alterações à forma nuclear e estrutura1,2, que geralmente são acompanhados de um amolecimento do núcleo3,4. Nuclear resistência à deformação mecânica tem sido geralmente caracterizada pela aplicação de uma força de núcleos isolados5.

O núcleo nas células molecularmente está ligado ao citoesqueleto pelo vinculador de Nucleoskeleton e citoesqueleto (LINC) complexo6,7,8,9. Como resultado, o núcleo mecanicamente é integrado com o citoesqueleto e, através de aderências célula-substrato, a matriz extracelular. Mecanicamente, sondar o núcleo no interior das células aderentes pode fornecer insights sobre essa integração mecânica. Métodos para manipular os núcleos em células vivas incluem micropipeta aspiração10,11e microscopia de força atômica a12,13,14. Recentemente descrevemos uma sonda de força direta (DFP) que se aplica forças mecânicas diretamente no núcleo em uma vida aderentes célula15.

Aqui, podemos descrever o procedimento para usar um sistema de microinjeção que está geralmente disponível em instalações de microscopia para aplicar uma força mecânica de nano-escala conhecida, diretamente para o núcleo em uma célula aderente. Um femtotip (0,5 µm ponta de micropipeta de diâmetro) é montado e ligado ao sistema de microinjeção por um tubo. A ponta, posicionada em um ângulo de 45° em relação à superfície do prato, cultura é abaixada até adjacente à superfície nuclear. O tubo é então desligado e aberto para a atmosfera, o que cria uma pressão negativa de sucção na superfície nuclear e lacra a ponta da micropipeta contra a superfície nuclear. Através da tradução da ponta da micropipeta, o núcleo é deformado e eventualmente (dependendo da magnitude da força aplicada), extraído da micropipeta. Este desprendimento ocorre quando as forças de restaura (oposição), exercidas pelo núcleo e célula, igual a força de sucção aplicada pela micropipeta. Análise pode ser realizada medindo-se o deslocamento do núcleo, a estirpe de comprimento (equação 1), ou a tensão da área (figura 1A).

Protocol

1. preparar células para a imagem latente Nota: A sonda de força direta (DFP) pode ser usada para qualquer tipo de células aderentes. Aqui, fibroblastos de rato do NIH 3T3 são usados como a linha celular do modelo para este protocolo. Células de fibroblastos cultura NIH 3T3 em modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 10% de soro de bovino doador e 1% penicilina-estreptomicina em um fundo de vidro 35mm prato até confluência desejada. Manter as células em 37…

Representative Results

Figura 2A mostra a força de um núcleo de fibroblasto NIH 3T3 rato. Como a ponta da micropipeta é traduzida para a direita, o núcleo deforma e eventualmente desanexa da ponta da micropipeta. A estirpe do comprimento do núcleo é vista a aumentar com o aumento da força de sucção (Figura 2B). Na extremidade dianteira do núcleo (micropipeta puxando a borda) forma uma protusão nuclear e a borda direita é deslocada de sua po…

Discussion

Medindo a integração mecânica do núcleo com o citoesqueleto é um desafio para métodos mais atuais, como micropipeta aspiração16, pois eles exigem ou núcleos isolados (onde o núcleo é dissociado do citoesqueleto) ou núcleos em células suspensos (onde forças extracelulares, como forças de tração, estão ausentes). Força aplicou-se para o núcleo aplicando tensão biaxial de aderente de células a uma membrana17,,18; no enta…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 EB014869.

Materials

FluoroDish WPI FD35
SYTO 59 ThermoFisher Scientific S11341
Femtotips  Eppendorf 930000043
InjectMan NI2 Eppendorf NA discontinued, current equivalent model: InjectMan 4
FemtoJet Eppendorf NA Current model FemtoJet 4i
Plan Fluor oil immersion 40x Nikon NA
Apo TIRF oil immersion 60x Nikon NA
Donor Bovine Serum (DBS) ThermoFisher Scientific 16030074 NIH 3T3 serum
Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) Mediatech cellgro MT10013CVRF NIH 3T3 medium
Penicillin-Streptomycin  Mediatech MT30004CIRF NIH 3T3 medium supplement
Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing Nikon 77007 Immersion oil for objective lens 

References

  1. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  2. Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
  3. Bank, E. M., Gruenbaum, Y. The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship. Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).
  4. Lammerding, J., et al. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).
  5. Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
  6. Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).
  7. Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins. Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).
  8. Tapley, E. C., Starr, D. A. Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).
  9. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  10. Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
  11. Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope. Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).
  12. Pagliara, S., et al. Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency. Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).
  13. Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).
  14. Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy. Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).
  15. Neelam, S., et al. Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).
  16. Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
  17. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  18. Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation. Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).
  19. Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells. Methods. 94, 27-32 (2016).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Q., Tamashunas, A. C., Lele, T. P. A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (137), e58038, doi:10.3791/58038 (2018).

View Video