Summary

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

Published: June 26, 2018
doi:

Summary

Descrevemos um ensaio óptico para vesícula sináptica (SV) reciclagem em neurônios cultivados. Combinar este protocolo com duplo transfeccao de expressar uma proteína de interesse e o marcador pré-sináptica nos permite localizar sites pré-sináptica, sua vesícula sináptica, capacidade de reciclagem e determinar o papel da proteína de interesse.

Abstract

Nos terminais de nervo pré-sináptica ativo, vesículas sinápticas passam por ciclos de exo e endocitose. Durante a reciclagem, os domínios luminal de proteínas transmembrana SV tornam-se expostos na superfície da célula. Uma destas proteínas é Synaptotagmin-1 (Syt1). Um anticorpo dirigido contra o domínio luminal de Syt1, uma vez adicionado ao meio de cultura, é retomado durante o ciclo exo-endocytotic. Esta absorção é proporcional à quantidade de SV reciclagem e pode ser quantificada através de imunofluorescência. Aqui, nós combinamos Syt1 absorção de anticorpos com duplo transfeccao de neurônios hippocampal culturas. Isso permite que nós (1) localizar sites pré-sináptica baseados na expressão do marcador pré-sináptica recombinante Sinaptofisina, (2) determinar sua funcionalidade usando Syt1 absorção e (3) caracterizar a segmentação e os efeitos de uma proteína de interesse, GFP-Rogdi.

Introduction

Estudando a vesícula sináptica reciclagem é importante em determinar como alteram Propriedades pré-sináptica, durante a plasticidade sináptica, ou em resposta a perturbação da função sináptica. Estudando Synaptotagmin-1 (Syt1) captação de anticorpo fornece um método para medir a quantidade de reciclagem de SV. Syt1 é uma proteína de SV-associado que atua como um sensor de Ca2 + e é necessária para os liberação do neurotransmissor1,2. É uma proteína transmembranar com um domínio citoplasmático do C-terminal fora o SV e um domínio N-terminal do luminal dentro do SV3. Durante a exocitose, o domínio luminal de Syt1 torna-se exposto ao meio externo. Para este meio externo, acrescentamos anticorpos dirigidos contra o domínio citoplasmático, que se torna interiorizado durante a endocitose. Estes anticorpos podem ser que também pre-conjugados com fluorophores ou immunostained com anticorpos secundários4,5,6,7. A intensidade da fluorescência do immunosignal resultante é proporcional à quantidade de reciclagem de SV. Esta abordagem pode ser usada para determinar o SV constitutiva e induzida por despolarização reciclagem6,8.

Ensaios de absorção de Syt1 podem ser realizados após a transferência de genes mediada por vírus para praticamente todas as células no prato ou transfection esparso de um pequeno número de células. Nosso método combina o ensaio com esparso transfection duplo de neurônios hippocampal preliminares usando o fosfato de cálcio9. Nós usamos uma proteína recombinante marcador conhecida a acumular-se no presynapses, Sinaptofisina fluorescente etiquetada, localizar terminais pré-sináptica e overexpress nossa proteína de interesse, Rogdi. Isto permite-nos testar ou não Rogdi alvos funcionais sinapses e afeta SV reciclagem. O gene que codifica a Rogdi foi originalmente identificado em uma tela para mutantes de Drosophila, caracterizados pela memória prejudicada10. Em humanos, mutações no gene Rogdi causam uma doença rara e devastadora, chamada síndrome de Kohlschütter-Tönz. Os pacientes sofrem de malformações do esmalte dentário e pharmacoresistant epilepsia psicomotoras atrasos; no entanto, a Localização subcellular do produto gene permaneceu evasivo11. Assim, o ensaio de absorção de Syt1 forneceu evidência chave para localização de GFP-etiquetado Rogdi às sinapses funcionais9.

Esta técnica de captação tem diversos benefícios. Primeiro, SV reciclagem pode ser observado tanto em tempo real através da realização de7,de imagens ao vivo12e após fixação6,9 , medindo a intensidade da fluorescência do rótulo Syt1 fluorescência. Além disso, foram desenvolvidas diversas variantes de Syt1 anticorpo. Existem variantes sem marcas de formatação que podem ser rotuladas com um anticorpo secundário, seguindo um protocolo padrão de imunocoloração após a fixação e variantes pre-conjugadas com um rótulo de fluorescência já anexado. Finalmente, baseados em anticorpo fluorescência é vantajosa devido a grande seleção de corantes secundários ou conjugados em comercialmente disponíveis que pode ser usado.

Quando fixação e imunocoloração os neurônios, é também possível mancha para proteínas adicionais e executar análise colocalization. Isto pode ajudar a determinar onde eles estão localizados em relação à reciclagem SVs. A intensidade do rótulo da fluorescência é a medida direta da quantidade de SV reciclagem. Além disso, os anticorpos seletivamente rotulam Syt1 contendo estruturas, resultando em alta especificidade e de fluorescência do pouco fundo4. Protocolos de estimulação diferentes também podem ser usados, tais como buffers de despolarização ou estimulação elétrica protocolos9,12,13,14. No entanto, reciclagem de SV basal pode ser medida sem estimular as culturas neuronal15.

Nosso método trata especificamente a absorção de anticorpo Syt1 nos neurônios duplo-transfectadas com anticorpo secundário immunolabeling após a fixação. No entanto, nos referimos a todas as variantes rotineiramente utilizadas do ensaio em nossa discussão para dar aos espectadores a oportunidade de adaptar o protocolo para necessidades específicas.

Protocol

Foi realizado nenhum estudo com animais vivos. Experimentos envolvendo animais sacrificados para obter culturas foram aprovadas pelas autoridades locais de proteção animal (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sob a aprovação de célula número T10/30. Os experimentos foram realizados com os protocolos aprovados. 1. primário de células Hippocampal cultura Prepare a cultura de células dissociadas do hipocampo rato em embrionárias dia 1916…

Representative Results

Um resultado esperado desta abordagem é localizar aproximadamente 50 duplo-transfectadas neurônios por lamela em uma densidade de 50.000 neurônios por bem. O axónio de cada neurônio é esperado para mostrar vários hotspots de acumulação Sinaptofisina fluorescente etiquetado, indicando aglomerados ofSVs. Em sites pré-sináptica funcionais, o sinal de Sinaptofisina recombinante colocalizes com punctate Syt1 fluorescência. Usando a transfeccao duplo, ou GFP-Rogdi como a proteína d…

Discussion

Existem três ensaios rotineiramente usados para estudar a vesícula sináptica (SV) reciclagem. Os dois primeiros incluem o uso de um) fluorescente styryl corantes como FM1-43 (que incorporar em membranas, são retomadas em organelas durante a endocitose e são liberados após a exocitose); e b) marcados fluorescentemente proteínas recombinantes do SV (que, em cima de superexpressão, incorporam as máquinas de reciclagem proteicas). Se o anexadas fluorophores alterar sua fluorescência dependendo do pH, pode ser usado…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Irmgard Weiss-assistência técnica especializada. Este trabalho foi apoiado pelo DFG através do Cluster de excelência para microscopia na escala do nanômetro e fisiologia molecular do cérebro (CNMPB, B1-7, a T.D.).

Materials

B27 Gibco 17504-044
BSA Sigma A7030-50g
CaCl2 Sigma-Aldrich C3306-100g
CoolSNAP HQ2 Photometrics
dH2O Invitrogen 15230
DABCO Merck 8.03456.0100
donkey anti mouse Alexa 647 Jackson-Immunoresearch 715605151 antibody
DMEM Invitrogen 41966
DPBS Gibco 14190
Eppendorf tubes Eppendorf 30120094
multiwell 24 well Fisher Scientific 087721H
tube (50 mL) Greiner Bio-One 227261
FBS superior BiochromAG S0615
Glucose Merck 1,083,421,000
HBSS Invitrogen 14170
HEPES Sigma H4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator) ThermoElectron Corporation
KCL Sigma-Aldrich P9541-500g
L-Glutamin Gibco 25030
MgCl2 Honeywell M0250-500g
microscope slides Fisher Scientific 10144633CF
Microsoft Excel Microsoft
Mowiol4-88 Calbiochem 475904
NaCl BioFroxx 1394KG001
Na2HPO4 BioFroxx 5155KG001
Neurobasal Invitrogen 21103049
OpenView Experiment Analysis Application Free software, see comments written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel
PBS (10x) Roche 11666789001
Optimem Invitrogen 31985
Penstrep Gibco 15140-122
PFA Sigma P6148-1kg
safety hood ThermoElectron Serial No. 40649111
Sucrose neoFroxx 1104kg001
Synaptotagmin1 Synaptic Systems 105311 mouse monoclonal; clone 604.2
Triton X-100 Merck 1,086,031,000
Vortex Genius 3  IKA 3340001
Water bath GFL 1004
Zeiss Observer. Z1  Zeiss

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Cite This Article
Riemann, D., Petkova, A., Dresbach, T., Wallrafen, R. An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins. J. Vis. Exp. (136), e58043, doi:10.3791/58043 (2018).

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