Summary

צמיחה אנאירובית ותחזוקה של שורות תאים בתרבית

Published: July 21, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת טיפוח לטווח ארוך אנאירובית של שורות תאים הוקמה. הזמן המרבי הישרדות שבו נבדקה הוא 17 ימים. שיטה זו מתאימה בדיקה של סוכנים ציטוטוקסיות, חקר הפיזיולוגיה של anoxically שכפול התאים.

Abstract

ביותר הרירית משטחים יחד עם האמצע בין גידולים בתאי גזע נישות הם אזורים גיאוגרפיים של הגוף שאינן אנאוקסיים. מחקרים קודמים מראים כי הדגירה ב- normoxic (5% CO2 באוויר) או מחוסר חמצן (רמות חמצן נמוכות) תנאים ואחריו תוצאות אנאוקסיים דגירה (היעדרות של חמצן חופשי) ב מוגבלת הכדאיות (2-3 ימים). מתודולוגיה הרומן פותחה המאפשרת של הטיפוח סלולריים אנאוקסיים (עבור פחות 17 ימים; משך הזמן המרבי נבדק). ההיבט הקריטי ביותר של מתודולוגיה זו היא להבטיח כי אין חמצן הוא הציג לתוך המערכת. זה מתקבל על ידי degassing של התקשורת, ועל ידי צינורות שטיפה, מאכלים, מבחנות, פיפטות עם תערובת גז אנאירובית (H2, CO2, N2) ואחריו המתיר את החומרים כדי equilibrate לסביבה (ללא חמצן) אנאוקסיים לפני השימוש. טיפול נוספים החייבים אימון בעת רכישת photomicrographs על מנת להבטיח כי micrographs שהושגו אינם מכילים ממצאים. בהעדר חמצן, מורפולוגיה תאים זה שינו באופן משמעותי. שני morphotypes נפרדים מצוינים עבור כל התאים תוצרת anaerobically. ניתן להחיל את היכולת לגדול ולתחזק בתרבית של תאים, בהעדר חמצן לניתוח של פיזיולוגיה של התא polymicrobial אינטראקציות, אפיון biosynthetic הוחלף נגזר מסלולים עבור פיתוח תרופות הסרטן הרומן.

Introduction

קיימים תאים של גידולים מוצקים, נישות תאי גזע אלה המצפים את המשטחים הרירית בסביבות חווים רמות חמצן מופחתת, כולל אנוקסיה1,2,3,4. בארצות הפיזיולוגיות נורמלי, חמצון משתנה מעבר לזה של היפוקסיה אנוקסיה (העדר מוחלט של חמצן)5,6. ההבנה כי חמצן אטמוספרי משפיע לרעה על שכפול בתרבית של תאים, את צמיחת תאים במבחנה ניתן למטב בתנאים חמצן מדולדל דווח בשנות השבעים המוקדמות. . ריכטר ואח 7 הראה כי רמות החמצן (היפוקסיה)-1-3% משופרת ציפוי יעילות לעומת חמצן אטמוספרי (20%). תוחלת החיים של האדם תא דיפלואידי נמתח גם התנאים תרבות ובשפתיים8.

In vivo, תנאים ובשפתיים להתרחש כאשר חנויות חמצן מדולדל (למשל, במהלך פעילות גופנית אינטנסיבית), שבו ייצור ATP הוא החליף בשריר השלד של נשימה אירובית כדי התסיסה (נשימה אנאירובית) עם המוצר הסופי של חומצה לקטית9. פתולוגית, בגידולים סרטניים, הפנים של הגידול בנפח גדול הוא ובשפתיים כדי אנאוקסיים בשל עניים vascularization10. השפעת זלוף מוגבלת על הגידול פנים תאומת באופן עצמאי על-ידי הגידול פנים בידי אווירני anaerobes1. Mechanistically, גידול התא הישרדות היפוקסיה נחשב להיות תלויים אך ורק הביטוי של הגן גורם היפוקסיה-inducible 1-אלפא (HIF1-alpha), וזו התגובה הספונטנית הראשונית היפוקסיה4,11 , 12. HIF1-אלפא הנגרמת מחוסר חמצן בתנאים על ידי חלבוני הלם חום לאגד את HIF1-מקדם אלפא ו upregulate שעתוק גנים12. אלו חלבונים הלם חום הם האמינו כדי לסייע אינדוקציה של פנוטיפים שונים אצל microenvironment שתקבעו הגידול. אלה פנוטיפים התערוכה ביטוי מוגבר של קרום התא הגלוקוז למעליות, הקצב של גליקוליזה (אפקט ורבורג)13. התוצאה היא מתג מ מיטוכונדריאלי זרחון חמצוני כדי לקטט תסיסה.

הישרדות אנאוקסיים יכולים לנצל גם חלופות גלוקוז כדי לתמוך את התופעה14,של הישרדות15. הדוגמה יונקים למד בצורה הטובה ביותר היא העכברוש השומה, אשר יכול לשרוד במשך כמעט 20 דקות בלי חמצן דרך מסלול מונחה פרוקטוז תסיסה glycolytic14. עיבוד חלופיות מתרחשת אצל דגים מסוימים (למשל, קרפיון [קרסיוס sp.], אשר יכול לשרוד באופן משמעותי יותר פרקי זמן שימוש גליקוליזה עם אתנול תוצר לוואי מסוף)15. בשני המקרים, תסיסה מניע את חילוף החומרים הפעלת הישרדות בהיעדר חמצן. ההשערה הנוכחי להישרדות אנאוקסיים זה כל כך הרבה זמן כמו HIF1-אלפא מופעל במהלך היפוקסיה, נשימה מיטוכונדריאלי, ללא צורך חמצן, מתרחשת תחת תנאים אנאירוביים16. יתר על כן, זה הוא שמהווה השימוש שביל fermentative להישרדות ובשפתיים/אנאוקסיים משפר הישרדות הגידול מאז התאים למנוע סטרס חמצוני, אשר יכול להוכיח להיות מזיקה הישרדות תא17. אקסיומת זה נתמך על ידי מחקר שנערך לאחרונה, אשר מראה כי בעוד cardiomyocytes, היפוקסיה מפחית את הלחץ חמצוני על ה תא הגידול17.

עד כה, מהות חיוני שביל fermentative להישרדות אנאוקסיים בתרבית של תאים יש כבר טבוע עמוק בספרות, בשל, במידה רבה, עד לחוסר בתאים בתרבית של תרבות העדר מוחלט של חמצן במשך יותר מ- 3 ימים. עם זאת, אלטרנטיבה גליקוליזה למען הישרדות אנאירובית מתרחשת אצל חיידקים. בחיידקים מסוימים, חנקן או סולפט (בין תרכובות אחרות) יכול לשמש acceptors אלקטרון מסוף עבור מערכת ציטוכרום אוקסידאז בהיעדר חמצן18. למרות ההתפתחות בקטריאליים ו האיקריוטים התרחשה במקביל מאז מתפצל מן האב נפוצות הקדמון, ההערכה היא כי המיטוכונדריה שאתם מספקים אנרגיה לתאים 1.542 מיליון שנה לפני חמצון של האוקיינוסים19 . מאז חוקרים יש הראו כי המיטוכונדריה מבודד יכול לייצר ATP בהעדר חמצן, עם חנקיתי כמו מקבל אלקטרון מסוף, סביר להניח כי תאים שיכלה לשמש לפרקי זמן ארוכים יותר מ-3 ימים בהיעדר חמצן 20 , 21 , 22 , 23. המתודולוגיה המתוארים במחקר זה יש כלי הגידול אנאירובית בתרבית של תאים של שורות תאים רבים.

Protocol

1. מכינים את המדיה לתרבות אנאירובית של קווי בתרבית של תאים שונים להפוך את המדיום PS-74656 מלאה עבור התרבות תאים אנאוקסיים25. להפוך את הפתרון מניות חנקיתי סטרילי (5 מ’; 100 x) על ידי המסת 17.25 גר’ חנקיתי ב 50 מ של מים מזוקקים יונים, ואז לסנן לחטא זה. להוסיף 0.5 מ”ל של ה?…

Representative Results

הכוח של פרוטוקול זה שקרים תמיכתה תוחלת החיים וגידול של שורות תאים מרובים, ההכרה כי יש שינוי מעמיק עם סטייה מורפולוגיה תא25. האלמנט הקריטי ביותר של מחקר זה היא העברת תחזוקת התאים תחת anaerobiosis קפדנית. פעולה זו דורשת תא אנארובי מאורגנת על מנת למקסם את הפרוטוקול (<stro…

Discussion

שיטה זו מייצגת בפעם הראשונה בתרבית של תאים היו תרבותי לתקופות ממושכות של זמן בהעדר חמצן. על סמך תצפיות הנוכחי, הצמיחה אנאוקסיים יכולת דרך שביל fermentative נראה אוניברסלי בין תאים בתרבית של שורות28, שבו הגידול אנאירובית, גרמו פנוטיפ גאוס. זה נצפתה עבור כל השורות תא נבדק. עם טיפוח…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לבנק אוניברסיטת Office של מחקר ותוכניות במימון על תמיכתם.

Materials

Whitney A35 anaerobic chamber Don Whitley Scientific  Microbiology International The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.
CO2 incubator Fisher Scientific 3531
Tissue Culture Hood Labconco DO55735
pipet aid Drummond 4-000-100
sterile transfer pipets Santa Cruz sc-358867
50cc sterile conical centrifuge tubes DOT 451-PG
vaccum jar Nalgene 111410862889 BTA-Mall 5311-0250
DMEM high glucose (4.5 g/L) CellGro 10-017-CM
DMEM low glucose (1 g/L) CellGro 10-014-CV
FBS VWR 1500-500
HBSS VWR 20-021-CV
trypsin VWR 25-052-CI
gentamicin Gibco 15750-060
sterile pipets CellTreat 229210B, 229205B
Tissue culture flask (T75 or T150) Santa Cruz sc-200263, sc-200264
24 well tissue culture treated dishes DOT 667124
glad ziplock sandwich bags Ziploc Costco
inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) Nikon Eclipse TS100
trypan blue Invitrogen T10282
hemocytometer Invitrogen C10283
Countess Automated Cell Counter Life Technologies AMQAF1000
Rainin microtiter pipets Mettler Toledo Rainin Classic Pipette PR-100
microtiter tips Santa Cruz Biotechnology sc-213233 & sc-201717 
test tube rack (50cc tubes) The Lab Depot HS29050A
sodium nitrite Sigma https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&region=US
clear boxes with lids Rosti Mepal Rubber maid
paper towels In House
cell scraper CellTreat 229310
PBS In house prepared
70% Ethanol Fisher Scientific 64-17-5
microcentrifuge tubes sterile Santa Cruz sc-200273
biohazard bags with holder (desktop) Heathrow Scientific HS10320
Nitrile Gloves VWR 89428
oxygen electrode eDAQ EPO354
pH meter Jenway 3510
pH paper/ pHydrion Sigma Aldich Z111813

References

  1. Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?. Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
  2. Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
  3. Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
  5. Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
  6. Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
  7. Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
  8. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
  9. Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  10. Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
  11. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
  12. Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
  13. Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
  14. Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
  15. Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
  16. Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
  17. Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
  18. Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
  19. Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
  20. Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
  21. Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
  22. Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
  23. Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
  24. Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
  25. Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
  26. Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
  27. Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
  28. Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
check_url/kr/58049?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines. J. Vis. Exp. (137), e58049, doi:10.3791/58049 (2018).

View Video