哺乳類セルラインの嫌気性成長と維持
Summary
ここでは、確立されたセルラインの嫌気の長期培養を可能にする新しい手法について述べる。テストされた最大生存期間は 17 日です。このメソッドは、細胞毒性薬のテストと、anoxically 複製細胞の生理機能の探索に適しています。
Abstract
腫瘍と幹細胞ニッチにおける中点と共に最も粘膜表面が無酸素体の地理的な領域です。先行研究により平地 (空気 5% CO2 ) で孵化が示す低酸素または限られた可能性 (2-3 日) で無酸素インキュベーション (遊離酸素の不在) 結果続く条件 (低酸素のレベル)。小説の方法論は、(少なくとも 17 日; 最大時間テスト) の無酸素の培養を可能にする開発されました。この手法の最も重要な側面は、システムに酸素が生じないことを確認することです。これは、脱ガス、メディア、フラッシュ チューブや料理、フラスコ、ピペット、嫌気性ガスの混合物 (H2CO2N2) と無酸素 (無酸素) 環境に釣り合うために材料を許可することによって続いてによって得られる使用する前に。ときに得られる顕微鏡写真には、成果物が含まれていないことを確認するため顕微鏡写真を取得、追加のケアを行使しなければなりません。酸素のない場合は、細胞の形態を大幅に変更します。嫌気成長のすべてのセルの 2 つの異なる型が記載されています。成長し、酸素のない状態で哺乳類の細胞を維持する能力は、細胞生理学、モデルの相互作用、および小説がん新薬開発の生合成経路の特性の解析に適用できます。
Introduction
固形腫瘍、幹細胞ニッチと粘膜の表面を裏から細胞が低酸素レベル、無酸素1,2,3、4を含む環境で存在します。通常の生理学的状態の酸素は低酸素血症低酸素 (酸素の完全な欠如)5,6のそれを越える異なります。大気中の酸素に悪影響哺乳類細胞複製劣化酸素条件下での in vitro細胞成長を最適化できる実現は、1970 年代初頭に報告されました。リヒターら7は、酸素レベル (低酸素) の 1-3% が大気中の酸素 (20%) と比較してめっき効率を高めることを示した。ヒト二倍体細胞の寿命は、低酸素培養条件8にも拡張されます。
酸素店が劣化 (例えば、激しい運動中に)生体内で、低酸素の条件が発生する発酵 (嫌気呼吸) に好気性の呼吸からの骨格筋における ATP の生産をスイッチにより前記の乳酸9の最終製品。悪性腫瘍、内部の病理、腫瘍の質量は貧しい血管新生による無酸素に低酸素10。義務づける嫌気性菌1によって植民地化腫瘍インテリアで腫瘍内部に限られた血流の影響は独立して検証します。機械論的に、低酸素の腫瘍細胞の生存は、低酸素誘導因子 1 α 遺伝子の発現に依存すると考えられる (HIF1-アルファ)、低酸素4,11初期の自発的な応答であります。,12. HIF1-アルファ、 HIF1をバインド熱ショックタンパク質に起因する低酸素の条件の下で-アルファ プロモーターと遺伝子転写12活性を上昇させる。これら熱ショック蛋白質は腫瘍低酸素環境で見られる様々 な表現型の誘導を支援するためと考えられています。これらの表現型は、細胞膜糖輸送担体の発現増加と解糖系 (Warburg 効果)13の率を表わします。その結果、乳酸発酵するミトコンドリアの酸化的リン酸化からスイッチです。
無酸素の生存はまた生存現象14,15をサポートするグルコースに選択肢を利用できます。最高の学び哺乳類の例はほくろのラットは、果糖駆動糖発酵経路14を介して酸素なしにほぼ 20 分間生き残ることができます。特定の魚の代替の適応が発生します (例えば、大幅に長く生き残ることができる鯉 [フナsp] の期間にターミナルの副産物としてエタノールと解糖系を使用して)15。両方のケースで発酵は酸素のない状態での生存を可能に代謝を駆動します。無酸素の生存のための現在の仮説は、長い間HIF1として-16嫌気的条件下で発生する酸素の必要性なしに、低酸素症、ミトコンドリア呼吸時にアルファがアクティブします。さらに、細胞は細胞生存17に有害であることを証明できる酸化ストレスを避けるので発酵経路の低酸素・無酸素の生存のための使用が腫瘍の生存率を高めることを仮定します。この仮説は、心筋、低酸素血症が腫瘍細胞17は、酸化ストレスを減少させることを示す最近の研究によってサポートされます。
日には、無酸素の哺乳類細胞の生存のための発酵経路の本質染み付いている文献、ため、できないこと 3 日以上酸素の完全な欠如に哺乳類細胞には、大部分の。しかし、細菌の嫌気性の生存のためには、解糖系の代わりに発生します。ある特定の細菌の窒素または硫酸 (他の化合物) の間では、酸素18の不在のチトクロム酸化酵素システムのターミナル電子アクセプターとして使用できます。ミトコンドリアが細胞にエネルギーを提供する 154 万 2000 年19 海の酸素化前に、の最後の普遍的な共通の祖先から分岐後並行発生した細菌や真核生物の進化が推定されています。.研究者は、分離ミトコンドリアがターミナル電子アクセプターとして亜硝酸の酸素の存在下で ATP を作り出すことができることを示しているので細胞が酸素のない状態で 3 日間よりも長い期間にわたって機能すると仮定するが妥当です。20,21,22,23. 本研究の方法論は多数の細胞の嫌気性の哺乳類細胞の成長のためのユーティリティ。
Protocol
Representative Results
Discussion
このメソッドは、酸素のない状態で長期間培養初めて哺乳類セルを表します。現在の観測に基づいて、無酸素成長機能を介して非発酵的経路嫌気性成長が表現型の相違で起因した哺乳類細胞ラインの28日間で普遍的なようであります。これはテストしたすべての細胞の観察されました。嫌気培養細胞の比率を増やす丸くなった、懸濁液のような人口を開発し、レプリ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、中西部大学研究局と主催のプログラムを彼らのサポートありがちましょう。
Materials
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
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