Анаэробные роста и поддержания линий клеток млекопитающих
Summary
Здесь мы опишем новый метод, позволяющий анаэробных долгосрочные культивирование установленных клеточных линий. Максимальная выживания время, которая была испытана — 17 дней. Этот метод подходит для тестирования цитотоксических агентов и изучения физиологии anoxically репликации клеток.
Abstract
Наиболее слизистой поверхности вместе с среднее положение в опухоли и ниш стволовых клеток являются географические области тела, которые аноксии. Предыдущие исследования показывают, что инкубации в нормоксические (5% CO2 в воздухе) или гипоксических условий (низкая кислорода) следуют результаты анаэробной инкубации (отсутствие свободного кислорода) в ограниченных жизнеспособности (2-3 дней). Была разработана Роман методология, позволяющая культивирования аноксии клеток (для по крайней мере 17 дней; максимальное время испытания). Наиболее важным аспектом этой методологии заключается в обеспечении, что нет кислорода вводится в систему. Это получается путем дегазации, средств массовой информации и путем промывки трубок и блюда, колбы, пипетки с анаэробной газовой смеси (H2, CO2, N2) следуют разрешительные материалы, чтобы сбалансировать в анаэробных (без кислорода) среде Перед использованием. Дополнительный уход должны осуществляться при приобретении микрофотографии чтобы убедиться, что получены микроскопии не содержат артефакты. В отсутствие кислорода морфологию клеток значительно изменены. Два отдельных Морфотипы отмечены для всех анаэробно выращенные клетки. Возможность расти и поддерживать mammalian клеток в отсутствие кислорода может применяться для анализа физиологии клетки, полимикробная взаимодействий и характеристика биосинтетических пути для развития Роман рака наркотиков.
Introduction
Клетки из солидных опухолей, ниши стволовых клеток и те подкладки слизистых поверхностей существуют в средах, которые испытывают снижение кислорода, включая гипоксия1,2,3,4. В нормальной физиологической государствах оксигенации меняется за гипоксии аноксии (полное отсутствие кислорода)5,6. Осознание что атмосферного кислорода отрицательно влияет на репликацию mammalian клетки, и что рост в пробирке клеток могут быть оптимизированы в условиях обедненного кислородом было сообщено в начале 1970-х годов. Рихтер и др. 7 показали, что 1-3% кислорода (гипоксии) повышение эффективности покрытия по сравнению с атмосферным кислородом (20%). Диплоидных клеток человека жизни также распространяется в условиях гипоксических культуры8.
В естественных условиях, гипоксических условий возникают, когда магазины кислорода обедненного (например, во время интенсивных физических упражнений), котором производства АТФ включен в скелетных мышцах от аэробного дыхания для ферментации (анаэробное дыхание) с конечный продукт молочная кислота9. Патологически, в раковой опухоли, интерьер опухоли масса гипоксических для анаэробных из-за плохой васкуляризации10. Эффект ограниченной перфузии на опухоль интерьеры независимо подтверждены опухоли интерьеры колонизирована облигатных анаэробов1. Механически, выживание клетки тумора в гипоксии считается исключительно зависит от экспрессии гена гипоксия индуцибельной фактор 1-альфа (HIF1-альфа), который является первоначальный спонтанной реакцией к гипоксии4,11 , 12. HIF1-альфа в гипоксических условиях индуцируется белков теплового шока, которые связывают HIF1-альфа-промоутер и upregulate транскрипции гена12. Предполагается, что эти белки теплового шока помощи в индукции различных фенотипов, видели в гипоксических микроокружения опухоли. Эти фенотипы exhibit выражение увеличение глюкозы транспортеров клеточной мембраны и интенсивность гликолиза (Варбург эффект)13. Результатом является переход от митохондриальной окислительного фосфорилирования в кислоты брожения.
Аноксии выживания может также использовать альтернативы глюкозы для поддержки выживания явление14,15. Наилучшим учился млекопитающих примером является землекоп, которые могут выжить в течение почти 20 минут без кислорода через фруктоза driven гликолитических ферментации путь14. Альтернативные адаптации происходит в некоторых рыб (например, карп [караси sp.], которые могут выжить в течение значительно дольше периоды времени, с использованием гликолиз с этанолом как субпродукт терминала)15. В обоих случаях ферментация диски метаболизма, позволяя выживания в отсутствие кислорода. Текущий гипотеза для анаэробных выживание является то, что так долго как HIF1-альфа активируется при гипоксии, митохондриальное дыхание, без необходимости для кислорода, происходит в анаэробных условиях16. Кроме того это постулируется, что использование ферментативным путь аноксии/гипоксии выживания улучшает выживания опухоли, поскольку клетки избежать Оксидативный стресс, который может оказаться пагубным для выживания клетки17. Этот постулат поддерживается недавнего исследования, которое показывает, что в кардиомиоцитов, гипоксия уменьшает окислительного стресса на клетки опухоли17.
На сегодняшний день, основополагающий характер ферментативным пути для выживания аноксии mammalian клетки было укоренилось в литературе, должным образом, в значительной степени, неспособность культуры mammalian клеток в условиях полного отсутствия кислорода для более чем 3 дней. Однако альтернативой гликолиз для анаэробных выживания происходит в бактерии. В некоторых бактерий азот или сульфат (среди других соединений) может служить акцепторами терминала электронов для системы цитохрома оксидазы в отсутствие кислорода18. Хотя параллельно бактерий и эукариот эволюции момента отхода от последнего общего предка универсальный, подсчитано, что митохондрии обеспечение энергии для клеток 1.542 миллионов лет до оксигенации океанов19 . Так как исследователи показали, что изолированных митохондриях может производить АТФ в отсутствие кислорода, с нитрита как терминал электрон акцептора, это разумно предположить, что клетки могут функционировать для периодов времени, более чем 3 дней в отсутствие кислорода 20 , 21 , 22 , 23. по методике, описанной в этом исследовании есть утилита для роста анаэробных mammalian клетки многочисленных клеточных линий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод представляет впервые mammalian клеток, которые были культивировали для длительных периодов времени в отсутствие кислорода. Основываясь на текущих наблюдениях, аноксии роста потенциала через не ферментативную путь представляется универсальный среди mammalian клеток линий<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Midwestern университета Управление по исследованиям и поддержке программ за их поддержку.
Materials
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?. Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
