L'identificazione di feromoni Petromyzon marinus mediante frazionamento analisi biologica-Guida
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per isolare e caratterizzare la struttura, la potenza olfattiva e la risposta comportamentale dei composti di feromone presunto di lamprede di mare.
Abstract
Frazionamento analisi biologica-guida è un approccio iterativo che utilizza i risultati delle analisi biologiche fisiologici e comportamentali per guidare l’isolamento e l’identificazione di un composto attivo feromone. Questo metodo ha provocato la riuscita caratterizzazione dei segnali chimici che funzionano come i feromoni in una vasta gamma di specie animali. Lampreda di mare si basano su olfatto per rilevare i feromoni che mediano le risposte comportamentali o fisiologiche. Usiamo questa conoscenza della biologia dei pesci a postulare funzioni di putativi feromoni e per guidare l’isolamento e l’identificazione dei componenti attivi di feromone. Cromatografia è usata per estrarre, concentrarsi e separare composti dall’acqua climatizzata. Electro-olfactogram (EOG) registrazioni sono condotte per determinare quali frazioni elicitare risposte olfattive. Analisi comportamentale di due-scelta labirinto vengono quindi utilizzate per determinare se uno qualsiasi delle frazioni odorose sono anche relativamente al comportamento attivo e indurre una preferenza. Spettroscopici e spettrometrici metodi forniscono il peso molecolare e strutturale informazioni per assistere con la delucidazione della struttura. La bioattività dei composti puri è confermata con analisi comportamentale ed EOG. Le risposte comportamentali osservate nel labirinto, in definitiva, devono essere convalidate in un ambiente di campo per confermare la loro funzione in un ambiente naturale flusso. Queste analisi biologiche giocano un doppio ruolo per 1) guida il processo di frazionamento e 2) confermare e definire ulteriormente la bioattività di componenti isolati. Qui, segnaliamo i risultati rappresentativi di un’identificazione del feromone di lampreda di mare che esemplificano l’utilità dell’approccio frazionamento analisi biologica-guida. L’identificazione di feromoni lampreda di mare è particolarmente importante poiché una modulazione del suo sistema di comunicazione di feromone è fra le opzioni considerate per controllare la lampreda di mare dilagante in grandi laghi Medicea Laurenziana. Questo metodo può essere facilmente adattato per caratterizzare la comunicazione chimica in una vasta gamma di taxa e gettare luce sull’ecologia chimica a base acquosa.
Introduction
I feromoni sono specifici segnali chimici rilasciati dagli individui che li aiutano nell’individuazione di fonti di cibo, rilevamento di predatori e mediare le interazioni sociali di conspecifici1. Comunicazione di feromone negli insetti è stato ben studiato2; Tuttavia, l’identificazione chimica e funzione biologica dei feromoni di vertebrati acquatici non sono stati studiati come ampiamente. Conoscenza dell’identità e della funzione dei feromoni rilasciati possono essere applicati per facilitare il recupero di specie minacciate3,4 o controllo dei parassiti specie5,6. L’applicazione di queste tecniche richiedono l’isolamento e la caratterizzazione dei componenti bioattivi feromone.
Identificazione di feromone è una branca della chimica dei prodotti naturali. Progresso nella ricerca di feromone è stato parzialmente limitato a causa della natura delle molecole feromone stesse. I feromoni sono spesso instabili e rilasciato in piccole quantità, ed esistono solo alcune tecniche di campionamento per rilevare piccole quantità di volatili7,8 o9di composti solubili in acqua. Approcci per identificare i feromoni includono 1) uno screening mirato di composti conosciuti, 2) metabolomica e frazionamento 3) analisi biologica-guida. Uno screening mirato di composti noti test disponibili in commercio sottoprodotti metabolici dei processi fisiologici supposti per funzionare come i feromoni. Questo approccio è limitante perché i ricercatori possono testare solo composti noti e disponibili. Tuttavia, ha provocato l’identificazione riuscita degli ormoni sessuali nel pesce rosso che la funzione come feromoni10,11,12. Metabolomica è un secondo metodo di identificazione di feromone che contraddistingue i prodotti metabolici piccola molecola potenziale all’interno di un sistema biologico13. Un confronto dei profili metabolici dei due gruppi (cioè, un attivo contro un estratto inattivo) consente l’identificazione di un profilo metabolico potenziale da cui il metabolita viene purificato, la struttura è stata chiarita e la bioattività è confermata14. Effetti additivi o sinergici delle complesse formulazioni di miscele specifiche sono più probabili essere rilevato con metabolomica poiché i metaboliti sono considerati insieme, piuttosto che come una serie di frazioni13. Ancora, l’implementazione della metabolomica si basa sulla disponibilità di riferimenti sintetici perché i dati risultanti non facilitano la delucidazione di nuove strutture.
Frazionamento analisi biologica-guida è un approccio iterativo che si estende su due campi: chimica e biologia. Questo approccio utilizza i risultati delle analisi biologiche fisiologici e comportamentali per guidare l’isolamento e l’identificazione di un composto attivo feromone. Un estratto grezzo è frazionato da una proprietà chimica (cioè, dimensioni molecolari, polarità, ecc.) e testato con electro-olfactogram (EOG) registrazioni e/o in un’analisi biologica. I componenti bioattivi sono proiettati ripetendo questi passi di frazionamento ed EOGs e/o le analisi biologiche. Le strutture di composti attivi puri sono delucidate da metodi spettroscopici e spettrometrici, che forniscono il peso molecolare e strutturale informazioni per produrre un modello del composto da sintetizzare. Frazionamento analisi biologica-guida può produrre metaboliti diversi e potenzialmente romanzo feromoni con scheletri chimici unici che difficilmente essere predetto dalle vie biosintetiche.
Qui, descriviamo il protocollo di frazionamento analisi biologica-Guida utilizzato per isolare e caratterizzare la bioattività di lampreda di mare maschio sesso composti di feromone. La lampreda di mare (Petromyzon marinus) è un modello ideale di vertebrati di studiare comunicazione di feromone, perché questi pesci si basano molto sulla rilevazione olfattiva dei segnali chimici per mediare la loro storia di vita anadroma composto da tre fasi distinte: le larve, giovanile e adulto. Petromyzon marinus larve traforare il sedimento di corsi d’acqua dolce, subiscono una drastica metamorfosi e trasformano in novellame che migrano a un lago o un oceano dove essi parassitano pesci di host di grandi dimensioni. Dopo aver scollegato dal pesce host, gli adulti migrano indietro in flussi di deposizione delle uova, guidati dai migratori feromoni rilasciati da larve di flusso-residente15,16,17,18,19 . I maschi maturi salire verso le zone di riproduzione, rilascia un feromone sessuale multi-componente per ottenere gli accoppiamenti, in modo intermittente deporre le uova per circa una settimana e poi morire15,20. L’identificazione di feromoni lampreda di mare è importante poiché una modulazione del sistema di comunicazione di feromone è fra le opzioni considerate per controllare le lamprede di mare dilagante nel Laurentian Great Lakes21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pesci vivono in un mondo chimico completo di composti ancora da identificare. Frazionamento analisi biologica-guida ha dimostrato essenziale per identificare e caratterizzare molecole bioattive che mediano molte interazioni chimiche, come quelle osservate in salmone masu31, elefanti asiatici32e lamprede di mare33, 34,35. Frazionamento analisi biologica-guida è un approccio effica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l’US Geological Survey Hammond Bay stazione biologica per l’utilizzo delle loro strutture di ricerca e il personale del U.S. Fish e Wildlife Service e della pesca e degli oceani Canada per la fornitura di lamprede di mare. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dalla Commissione per la pesca dei grandi laghi a Weiming Li e Ke Li.
Materials
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
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