Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1
Summary
אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.
Abstract
Assay זו נועדה במיוחד הדו ח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. וירוס כתב בלתי HIV-1 (HIV-1 iCre-איסור פרסום) נוצר על-ידי הוספת Cre recombinase לתוך הגנום HIV-1 בין המטריקס את החלבונים capsid של polyprotein איסור הפרסום. זה תוצאות באריזה Cre recombinase לתוך חלקיקי וירוס, אשר לאחר מכן שוחרר לתוך תא היעד קו stably לבטא Cre מופעל recombinase אדום פלואורסצנטי חלבון (RFP) בקלטות מתג ה-GFP. במצב הבזליים, הקלטת הזאת מבטאת רק RFP. בעקבות מסירת Cre recombinase לתוך תא היעד, RFP, ולצדו באתרים loxP, excises, והתוצאה היא ביטוי GFP. Assay זה יכול לשמש כדי לבדוק כל מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא, נעשה שימוש כדי לזהות מחלקה של היריבים קולטן purinergic מעכבי הרומן של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1.
Introduction
הצורך טיפולים חדשניים תרופתי יש בקשה הפיתוח של תריסים מעכבי של HIV-1 ערך תפוקה גבוהה. איסור פרסום-iCre כתב וזמינותו מפותחת לזהות מעכבי כניסה ויראלי בשלב פיוז’ן במערכת-לתא זיהום על ידי מדידת במיוחד ממברנה ויראלי פיוז’ן עם קרום התא המארח1. Assay פותחה עבור מעכבי הרומן כי פעלו במיוחד בשלבים מוקדמים של זיהום ב- HIV-1 עד לנקודה של קרום ויראלי היתוך מסך. אתגר אחד כדי מדידה תא-תא זיהום הוא inoculum הראשוני מכיל תאים נגועים התורם ותאי המטרה ininfected, ולכן מדידת זיהום חדש קשה להפלות את התאים קלט. המערכת אידיאלית מערבת סמן גנטי heterologous זה יכול להיגרם על ידי אתחול של זיהום תא היעד ואינו נוכח בתא התורם. מסגרת תוכן ויראלי פופולרי ערבוב assay מבוסס על שילוב חלבון נגיפי-אנזים, בלאם-Vpr, יכול להיות יעיל, אבל יש מגבלות עבור תפוקה גבוהה, תא-תא ההקרנה2. Assay הזה כרוך גן כתב בטא לקטמאז (בום) כי דבוקה Vpr HIV-1, הארוזים לתוך virions, מועברת לתוך תאי היעד על קרום ויראלי פיוז’ן. המצע CCF2-אם הוא טעון לתוך הציטופלסמה של התאים היעד, עובר פלורסצנטיות משמרת על המחשוף. המצע CCF2-אם הוא יקר וניתן אוסרני עבור מסכי תפוקה גבוהה. על מנת להבחין בין תאי התורם ואת המטרה, יש צורך לצבוע תווית קהלי היעד. לבסוף, הפרוטוקול מחייב מספר שלבים רוחצים את הדגירה אשר יכול להיות מעיק ויקרות בעת בדיקת מספר רב של תרכובות.
וזמינותו איסור פרסום-iCre פותחה כפתרון לסוגיות הללו, לפתח הקרנת עבור מעכבי של פיוז’ן-לתא בשידור של תפוקה גבוהה. מערכת זו אינה דורשת מצע שיש לטעון לתוך התאים. וזמינותו יכול לשמש גם ללימודים ללא תאים, ניתנת להתאמה מחקרים אחרים פיוז’ן ויראלי באמצעות חלקיקי וירוס HIV-1 איסור פרסום-iCre מדומים מוקלד. HIV Env מתווכת תא-cell fusion מבחני יכול למדוד וירוס Env בתיווך חלבון תאי היתוך, אולם אלה אין להשתמש חלקיקי וירוס בפועל כמו וזמינותו HIV-1 איסור פרסום-iCre3,4,5. Assay הזה ניתן לקרוא עם מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה שימש בהצלחה למסך את ספריית ה-FDA, כמו גם ספרייה קטנה של purinergic מעכבי1,6. חוקרים אחרים זיהו גם מעכבי purinergic ב- HIV-1 היתוך באמצעות וזמינותו של פיוז’ן תפוקה גבוהה המותאמים וממוטב מדווח על העברת וירוס-אנקפסולציה בטא לקטמאז לתוך הציטופלסמה7,8 .
הווירוס איסור פרסום-iCre תוכנן עם גישה דומה לנגיף איסור פרסום-iGFP, החדרת Cre recombinase בין מטריקס capsid, ולצדו אתרי פרוטאז HIV-19. האנזים Cre עשוי כמבשר מוכנס בתוך polyprotein איסור פרסום זה מבשיל פרוטאז HIV-1 מופעל בתוך החלקיק וירוס המתהווה. המשלוח Cre הוא, לפיכך, תלויה מסירת התכנים של חלקיק מופעל פרוטאז HIV-1 לתוך היעד התא באמצעות תהליך היתוך ממברנה ויראלי. שתי גרסאות של הפרוטוקול ניתנים כאן. הראשון משתמש אוכלוסיה נגוע ב- HIV-1 כדי להדביק את התאים היעד, ללמוד שידור ישיר-לתא של HIV. הגירסה השנייה משתמש וירוס ללא תא ללמוד זיהום ויראלי נטול תאים. וזמינותו שידור לתא מקבל 7 ימים להשלמת מהיום שהתאים הם הקרת, או 5 ימים אם התאים נמצאים כבר הקרת, passaged. וזמינותו תא ללא זיהום יכול להתבצע ב 5 ימים אם התאים צריכים להיות הקרת ו- 3 ימים, אם התאים נמצאים הקרת, passaged. ההוראות ניתנות גם לייצר קו של תא המטרה (אדום-כדי-ירוק) RG סוג התא הרצוי (אם אינו נמצא בשימוש קו תא היעד שישנו RG) באמצעות פלסמיד נוצר על ידי המעבדה Clevers10. מומלץ כי אמצעי אבטחה המתאים נלקחים עם הוירוס ולא התאים לבטא וירוס זה וזמינותו. אנו מבצעים של חלק זה וזמינותו במתקן תרביות רקמה BSL2 + זיהומיות. לאחר התאים קבועים, ניתן לנתח הם ב cytometry זרימה רגילה ומתקני מיקרוסקופ.
כאן נתאר את היישום של זה וזמינותו למסך עבור הרומן תרכובות זה לעכב פיוז’ן ממברנה נגיפי HIV-1 (איור 1). קולטנים Purinergic הם מתווכים פרו-דלקתיים. המעבדה שלנו הוכיחה כי מעכבי לא בררניים של קולטני purinergic לפעול כמו מעכבי של פיוז’ן ממברנה נגיפי HIV-16. . מדווחים כי הניצול של זה וזמינותו של תפוקה גבוהה יכול לזהות הרומן מעכבי פיוז’ן של קרום נגיפי HIV-1. נדגים כי מעכב של המחלקה purinergic של קולטני מייצג מחלקה הרומן של מעכבי פיוז’ן ממברנה נגיפי HIV-1.
Protocol
Representative Results
Discussion
איסור פרסום-iCre וזמינותו הוכיחה להיות מאוד שימושי עבור מיון מועמדים סמים אשר עלול לעכב את שלב פיוז ‘ ן של שכפול ויראלי. בעת ביצוע וזמינותו הזה, הצעדים החשובים ביותר להשיג קליטה טובה דומים מבחני זיהום ויראלי ביותר. השלב הקריטי הראשון מפיק titers גבוהה של וירוס באיכות טובה. שלב זה דורש כי התאים 293T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIH/NIAID AI112423 ו- NIH/NIGMS GM113885 כדי בנימין ק’ חן ו- NIH/NIAID K08-AI120806 כדי טליה ה שוורץ. ברצוננו להודות על Icahn בית הספר לרפואה באוניברסיטת הר סיני של דין לזרום Cytometry הליבה.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D5546 | Media for 293 Cells |
| RPMI-1640 | Sigma Aldrich | R0883 | Media for Jurkats |
| Fetal Bovine Serum Albumin | Gibco | 16140-071 | Serum for 293 Cells |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.03 | Serum for Jurkat Cells |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | Penn/Strep used in both media |
| T75 Flasks | Corning | 3073 | Used for Culture of Jurkat Cells |
| 10cm Tissue Culture Plates | Corning | 430167 | Used for Culture of 293 Cells |
| 96 Well Plates (tissue culture Treated) | Corning | 3595 | Used for fusion assay |
| Polyjet Transfection Reagent | Signagen | SL100688 | Used to transfect 293 Cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-100ML | Used in wash steps |
| Hyclone Trypsin Protease | GE Healthcare Life sciences | SH30042.01 | For Trypsinization of 293 cells |
| Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | For Nucleofection of Jurkats |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare Life sciences | 17144002 | For Nucleofection of Jurkats |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | For all tissue culture |
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | For all tissue culture and liquid handling steps |
| Millex Syringe Filter (0.45 micron) | Millipore | SLHA033 | For filtration of virus |
| BD Slip Tip Sterile syringes | BD Diagnostics | 309656 | For filtration of virus |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | 2b | for Nucleofection of Jurkats (various models available) |
| BD Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | for flow cytometry analyss of samples | |
| Tissue Culture Hood | Various models | Fortessa 2 | |
| pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE | Addgene | 32702 | Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011). |
| pCL10a1 | Novus Bio | NBP2-29542 | Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996) |
| Gag-iCre | Benjamin Chen Lab | Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016). |
References
- Esposito, A. M., et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology. 490, 6-16 (2016).
- Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. C. A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes. Nature Biotechnology. 20, 1151-1154 (2002).
- Huerta, L., Lamoyi, E., Baez-Saldana, A., Larralde, C. Human immunodeficiency virus envelope-dependent cell-cell fusion: a quantitative fluorescence cytometric assay. Cytometry. 47, 100-106 (2002).
- Sakamoto, T., et al. Establishment of an HIV cell-cell fusion assay by using two genetically modified HeLa cell lines and reporter gene. Journal of Virological Methods. 114, 159-166 (2003).
- Herschhorn, A., et al. An inducible cell-cell fusion system with integrated ability to measure the efficiency and specificity of HIV-1 entry inhibitors. PLoS One. 6, e26731 (2011).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).
- Marin, M., et al. High-Throughput HIV-Cell Fusion Assay for Discovery of Virus Entry Inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 13, 155-166 (2015).
- Giroud, C., et al. Screening and Functional Profiling of Small-Molecule HIV-1 Entry and Fusion Inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 15, 53-63 (2017).
- Hubner, W., et al. Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1. Journal of Virology. 81, 12596-12607 (2007).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, 81-83 (2011).
- Pear, W. S., et al. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 8392-8396 (1993).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70, 5701-5705 (1996).
- Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium Phosphate Transfection. Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).
