Roman Biyomalzeme büyük kemik lezyonlar onarmak için tasarlanmış sayısı sürekli olarak kemik iyileşmesi geliştirmek ve kemik nakli ile ilgili komplikasyonlar aşmak amacı ile genişletiyor. Burada, önceden klinik biyouyumluluk Biyomalzeme kemik onarımı için test edilmesi için çok disiplinli bir strateji mevcut.
Büyük sendikasız kemik kırıkları ortopedik cerrahi önemli bir sorun vardır. Auto – ve allojenik kemik grefti böyle lezyonlar iyileşmek için mükemmel olmakla birlikte, onların kullanımı ile potansiyel komplikasyonları vardır. Böylece, maddi bilim adamları bu sorunların üstesinden gelmek için sentetik, biyouyumlu Biyomalzeme geliştiriyoruz. Bu çalışmada, Biyomalzemeler kemik onarımı için değerlendirmek için çok disiplinli bir platform sunuyoruz. Biz uzmanlık kemik biyoloji ve İmmünoloji vitro osteoklast (OC) ve osteoblast (OB) deneyleri ve kemik onarımı, immünojenisite ve alerjenite vivo içinde fare modelleri de dahil olmak üzere bir platform geliştirmek için birlikte. Biz nasıl deneyler yapmak, sonuçları özetlemek ve raporlamak biomaterial biyouyumluluk göstermektedir. Özellikle, test ettik OB canlılığı, farklılaşma ve Qafqaz ve OC canlılığı ve farklılaşma β-trikalsiyum fosfat (β-TCP) diskleri bağlamında. Ayrıca kemik grefti kemik kritik ölçekli kusur fare modeli tamir için klinik olarak kemik iyileşme erken faz üzerindeki etkilerini belirlemek için kullanılan piyasada bulunan bir malzeme olan bir β-TCP/kollajen (β-TCP/C) köpük test ettik. Paralel deneylerde, bağışıklık ve alerjik tepkiler farelerde değerlendirildi. Yaklaşımımız bir kemik biomaterial kemik iyileşmesi ve hastalarda onarım için kullanılan Biyomalzeme biyouyumluluk tahmin için gerekli parametreleri bir dizi ile bir biyolojik uyumluluk profili oluşturur.
Kemik onarımı ile hematom oluşumu, inflamasyon başlar karmaşık bir süreçtir, oluşumu ve1,2remodeling Nasıra. Ancak, kemik rejenerasyon olası kemik kırığı1,3boyut için sınırlıdır. Örneğin, büyük kemik kırıkları nedeni travma, kanser veya osteoporoz değil iyileşmek olmayabilir ve sendikasız kemik kırıkları denir. Bu kemik lezyonlar genellikle sağlıklı fizyolojik kemik onarım ve rejenerasyon teşvik için tedavi gerektirir. Şu anda, otogrefti ve homogreft kemik nakli seçim4 2.2 milyon kemik değiştirme işlemleri ile yaklaşımdır her yıl5. Gerçi bu yordamları yüksek başarı oranı var, komplikasyonlar, kemik, enfeksiyon, donör sitesi morbidite ve ret4Örneğin, sınırlı yer olabilir. Kemik doku mühendisliği için yeni alternatifler bu sorunları ele almak üzere aranan.
Doğal veya sentetik polimerler, biyo seramik veya metaller hücreleri ve biyoaktif molekülleri ile birlikte bağlı Biyomalzeme üzerinde artış6tasarımıdır. Mekanik özellikleri gibi multipl faktörler ve dolaşım ve kırık site7 hücreleri de dahil olmak üzere birden fazla yerel ve sistemik faktörleri geçerli şifa ve biyomalzeme bağlamında şifa fizyolojik kemik anlayışımızı bağlıdır ,8,9. Biyomalzeme kemik rejenerasyon için osteogenicity ve osseointegration10 tanıtmak için amaç ve ideal biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilen ve gözenekli (hücre göç, oksijen ve besin teşvik). Aynı zamanda ağrı gidermek için kırık sitesini desteklemek için yeterince güçlü olması gerek. Ayrıca, inflamatuar faktörlerin iyileşme süreci başlatmak için gereklidir. Ancak, biomaterial aşırı inflamasyon ve alerjik tepkiler neden olmaktadır, bu sınırlamak veya kemik11,12şifa inhibe. Böylece, disiplinler arası bir yaklaşım kemik onarım için geliştirilen Biyomalzeme değerlendirmek gereklidir.
Bu çalışmada, biz önceden klinik değerlendirme 1) Orthovita trikalsiyum fosfat oluşan bir piyasada bulunan Süngerimsi Kemik Grefti İkamesi olan köpük nanometre boyutunda saf β-trikalsiyum oluşan Vitoss temsilcisi malzemelerin mevcut fosfat (β-TCP) parçacıklar ve Type 1 sığır kollajen (C) (β-TCP/C köpük) ve 2) β-TCP diskler. Burada, biz birincil osteoblast (OB) kullanarak bu Biyomalzeme biyouyumluluk test göstermek ve osteoklast (OC) deneyleri, in vivo modeli kemik onarımı, vitro T lenfosit proliferasyonu oluşan immünolojik bir değerlendirme ve sitokin üretim ve in vivo immünojenisite ve alerjenite, daha önce bildirilen13olarak.
İşte, biyouyumluluk temsilcisi Biyomalzeme kemik rejenerasyon ve onarım için geliştirilmiş için preklinik değerlendirilmesi için çok disiplinli bir yaklaşım göstermektedir. OBs, OCs, yanıt test ettik ve bir kritik kemik defekti içinde vivo şifa yanıtta model fare gibi içinde in vitro ve in vivo bağışıklık yanıtı. Nasıl deneyleri çalışma ve veri ve biyomalzeme muayene elde edilen sonuçları özetlemek göstermek amaçlanmıştır. Biz bizim strateji kemik biomateria…
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma projesi Avrupa Birliği’nin yedinci çerçeve programı (FP7/2007-2013) fon Hibe Sözleşmesi No 263363 altında aldı.
Biomaterials | |||
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) | Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures. | ||
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) | Orthovita | 2102-1405 | |
Mouse osteoblast culture | |||
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 | Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10. | ||
Bone growth medium (BGM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin | ||
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate | Thermo Scientific | C7027 | Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. |
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | A13261 | |
Collagenase type IV from clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138 | |
DC protein assay kit II | Bio Rad | 5000112 | DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Steril-filter DMSO before usage. |
Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | E12020 | EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C9002 | |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
MEM alpha medium (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
Osteogenic mineralization medium (MM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate | ||
Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Sigmafast BCIP/NBT | Sigma-Aldrich | B5655 | |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15400054 | Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free | VWR | L0970-500 | |
Wash buffer | Add 0.05% Tween20 to 1x PBS. | ||
Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 1.08816 | |
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G5422 | |
24-well suspension culture plate | Greiner bio-one | 662102 | |
24-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 662160 | |
50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
96-well black plate | Greiner bio-one | 655076 | |
96-well transparent plate | Greiner bio-one | 655001 | |
Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
CO2-Incubator: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
Cryovial 2 mL | Greiner bio-one | 122263 | |
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 10462200 | For sterile filtration of enzyme solution. |
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo | Epson | ||
Infinite M200 Pro microplate reader | Tecan | ||
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL | VWR | 20901-505 | |
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL | VWR | 21008-959 | |
Shaker Swip (orbital and horizontal) | Edmund Buehler | ||
Shaking incubator GFL3032 | GFL | 3032 | |
Single-use pipet: serum pipet | Greiner bio-one | 612301 | |
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps) | |||
Tissue culture plate (10 cm) | Greiner bio-one | 664960 | |
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture | |||
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma-Aldrich | 17936 | 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%) |
Acetone | VWR Chemicals | 22065.327 | |
Bone growth medium (BGM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin | ||
Distilled water | Carl Roth | 3478.4 | |
Ethanol (100% vol/vol) | VWR Chemicals | 20821.365 | |
Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
Fast red violet LB salt | Sigma-Aldrich | F3381 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
MEM alpha Medium (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
Naphthol AS-MX phosphate | Sigma-Aldrich | N4875 | |
Osteoclast differentiation medium (DM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 | ||
Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Cayman Chemical Company | 9003016 | 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%) |
Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
Sodium tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | S8640 | |
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel) | |||
TRAP buffer pH 5.0 | Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5. | ||
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free | VWR | L0970-500 | |
24-well suspension culture plate | Greiner bio-one | 662102 | |
24-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 662160 | |
50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
CO2-Incubator: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) | Buehler | ||
Isomet low-speed saw | Buehler | ||
Petri dish (6 cm) | Greiner bio-one | 628,161 | |
Screw cap glass bottle 20 mL | Carl Roth | EXY4.1 | |
Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
Single-use pipet: serum pipet | Greiner bio-one | 612301 | |
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' | Henry Schein Animal Health | 9003340 | |
Mouse calvarial defect model | |||
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) | Richter Pharma AG | ||
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) | Fresenius Kabi | ||
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin | Carl Roth | 2213.6 | |
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL | B. Braun Surgical | 1050060 | |
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2'' | Henry Schein Animal Health | 9003340, 9003630 | |
Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
Sterile disposable scalpel (Figur 20) | Henry Schein Animal Health | 9008957 | |
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 16929000 | |
Handpiece type S-II | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 30056000 | |
Trephine, diameter 4 mm | Hager&Meisinger GmbH | 229040 | |
Irrigation tubing set 2.2 m | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 4363600 | |
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm | Henry Schein Animal Health | 472683 | |
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm | Henry Schein Animal Health | 300715 | |
In vitro immune responses | |||
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit | Sigma-Aldrich | 11647229001 | The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. |
Concanavalin A (ConA) | MP Biomedicals | 150710 | |
Culture medium splenocytes | RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids | ||
Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Gentamicin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15750037 | |
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard | BioLegend | 430801 | |
Non-essential amino acids solution | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse | BD Bioscience | 555899 | |
RPMI 1640 medium, HEPES | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 52400025 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
96-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
Cell strainer 40 µm | BD Bioscience | 352340 | |
Infinite M200 Pro microplate reader | Tecan | ||
Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides) | |||
High throughput intraperitoneal model | |||
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit | Thermo Scientific | 9990700 | For differential cell count. |
Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
Hemocytometer: Neubauer chamber | Carl Roth | PC72.1 | |
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
Resorbable suture: Polysorb | Covidien | SL-5628 | |
Shandon centrifuge for cytopsin | Thermo Scientific | ||
Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 | |
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
Trypan blue solution 0.4% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Subchronic subcutaneous model | |||
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin | Carl Roth | 2213.6 | |
Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 |