利用外束辐射对小型动物模型的多能干细胞衍生畸胎瘤进行靶向选择性治疗
Summary
多能干细胞衍生畸胎瘤治疗策略的研究对干细胞治疗的临床翻译具有重要意义。在这里, 我们描述了一种协议, 首先, 在小鼠体内产生干细胞衍生的畸胎瘤, 然后, 选择性地靶向和治疗这些肿瘤在体内使用一个小动物辐照器。
Abstract
在全球范围内, “干细胞旅游” 这一无管制的干细胞移植的受害者越来越多, 这引起了人们对干细胞移植安全性的担忧。虽然分化而非未分化细胞的移植是常见的做法, 畸胎瘤仍然可以产生于残留的未分化干细胞在移植时的存在或自突变在分化细胞。由于干细胞疗法通常被提供到解剖敏感的部位, 即使是小肿瘤也可能在临床上造成毁灭性的破坏, 导致失明、瘫痪、认知异常和心血管功能障碍。手术进入这些场所的机会也可能有限, 使患者几乎没有治疗选择。因此, 控制干细胞不当行为对干细胞治疗的临床翻译至关重要。
外部光束辐射提供了一种有效的手段, 提供有针对性的治疗, 以减少畸胎瘤的负担, 同时尽量减少对周围器官的伤害。此外, 这种方法避免遗传操作或干细胞的病毒转导-这与额外的临床安全性和疗效问题有关。在这里, 我们描述了一种在小鼠体内创建多能干细胞衍生畸胎瘤的方案, 并应用外束放射治疗在体内选择性地消融这些肿瘤。
Introduction
在过去几十年里, 组织再生干细胞疗法的发展遇到了一些障碍, 阻碍了有效临床部署的努力。这些障碍包括分娩部位细胞保留不良、干细胞免疫原性和肿瘤形成畸胎瘤1的可能性。致瘤是特别的临床关注, 因为它可能有潜在的危害干细胞移植受者2。由于不受管制的干细胞注射而形成的肿瘤的说法已经在多个临床环境中报告了 3,4,5。畸胎瘤形成的可能性是多能干细胞 (psc) 发展中最经常提到的临床问题, 并导致多个高调胚胎干细胞 (esc) 和诱导多能干细胞 (ipsc) 的延迟和取消试验6,7,8,9。因此, 有迫切需要一个翻译调查致力于提供适当的治疗, 如果这些医源性肿瘤出现。
到目前为止, 控制干细胞不当行为的大多数策略都集中在减少有致瘤潜力为 2,10的 psc 数量上。遗憾的是, 畸胎瘤的形成只需要少量的残留细胞 (例如, 1 x10 4至 1 x10 5细胞11), 远远低于目前可用的检测 12所引用的检测限值,13. 使用这些预分配方法的其他限制包括效率低和费用高、依赖可能不适合较新的组织工程方法的单细胞悬浮液以及细胞的潜在损伤生存和雕刻。
很少有研究涉及畸胎瘤形成后的治疗方案。也许最深入研究的策略是将 “自杀” 基因整合到干细胞中 14,15。这种方法包括基因操纵干细胞, 以纳入诱导凋亡激活基因, 可通过药物刺激后注射激活, 从而提供一种救援方法, 如果注射细胞产生畸胎瘤。然而, 这种方法存在重大缺陷, 包括私营保安公司基因改造的非目标效应和耐药的逐渐发展的可能性 16.类似的方法利用小分子通过抑制抗凋亡途径诱导psc 选择性细胞死亡17。其他群体使用多能性表面标记抗体, 如 podocalyxin-like (podxl)18, 将其靶向 psc 的细胞死亡。小分子或抗体传递的时间如果传递过早, 将对 psc 的治疗潜力产生重大影响, 如果传递得太晚, 可能缺乏治疗效果。此外, 还没有研究以这种方式使用的小分子和抗体的系统性影响。
治疗这些肿瘤的另一种方法依赖于使用外束放射治疗 (ebrt)。ebrt 是目前用于治疗实体肿瘤的主要方法之一.欧洲 brt 的创新, 包括质子束和立体定向放射外科的发展, 使病理结构的目标增强, 同时避免对正常组织的损害, 使保形欧洲爆炸器成为解决畸胎瘤的理想选择在解剖敏感的结构中形成20。此外, 这种方法避免了基因操纵或病毒转导的干细胞, 这两个充满了额外的临床安全性和有效性的问题15。最后, 微辐照器的发展使 ebt 在啮齿类动物21中的应用成为可能。
在本文中, 我们演示了如何通过在小鼠体内注射人的 ipsc 来创建小动物形成畸胎瘤的模型。然后, 我们展示了如何应用 ebrt 选择性地消除这些肿瘤在体内与最小的损害周围的组织。这种方法为 psc 衍生的畸胎瘤提供了有针对性的治疗, 同时避免了生物分子和肽的系统传递以及 psc 的基因操纵所产生的非目标效应。为了调查目的, 我们提供了一个可选的步骤, 通过生物发光成像 (bri) 来跟踪肿瘤对放射治疗的反应。
Protocol
Representative Results
Discussion
“干细胞旅游” 受害者的临床前数据和传闻案例证实, 患上畸胎瘤的风险是与 psc 治疗23有关的一个严重缺陷。因此, 制定谨慎的方法来预防和治疗与干细胞疗法相关的肿瘤风险是促进再生干细胞疗法临床翻译的一个重要步骤。在本文中, 我们描述了一种方法的治疗靶向靶向 psc 相关畸胎瘤使用 ebrt 在小鼠模型中, 并显示了动态萎缩的辐照肿瘤使用 bi 成像。
我们?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢国家卫生研究院 r01 hl134830 (pkn)、k08 hl135343 (ks) 和 5f32hl134221 (jwr);霍华德休斯医学院 (asl);和斯坦福心血管研究所 (asl) 的支持。
Materials
| Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
| Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
| Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
| Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
| Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
| Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
| Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
| X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
| RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
References
- Sallam, K., Wu, J. C. Embryonic stem cell biology: insights from molecular imaging. Methods in Molecular Biology. 660, 185-199 (2010).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nature Medicine. 19 (8), 998-1004 (2013).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLOS Medicine. 6 (2), e1000029 (2009).
- Kuriyan, A. E., et al. Vision Loss after Intravitreal Injection of Autologous "Stem Cells" for AMD. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1047-1053 (2017).
- Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375, 196-198 (2016).
- Zhang, W. Y., de Almeida, P. E., Wu, J. C. Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research. StemBook. , (2012).
- Scott, C. T., Magnus, D. Wrongful termination: lessons from the Geron clinical trial. STEM CELLS Translational Medicine. 3 (12), 1398-1401 (2014).
- Strauss, S. Geron trial resumes, but standards for stem cell trials remain elusive. Nature Biotechnology. 28 (10), 989-990 (2010).
- Coghlan, A. Unexpected mutations put stem cell trial on hold. New Scientist. 227 (3033), 9 (2015).
- Tang, C., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nature Biotechnology. 29 (9), 829-834 (2011).
- Lee, A. S., et al. Effects of cell number on teratoma formation by human embryonic stem cells. Cell Cycle. 8 (16), 2608-2612 (2009).
- Tano, K., et al. A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system. PLoS One. 9 (10), e110496 (2014).
- Kuroda, T., et al. Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells. PLoS One. 7 (5), e37342 (2012).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation. 113 (7), 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular imaging of embryonic stem cell misbehavior and suicide gene ablation. Cloning Stem Cells. 9 (1), 107-117 (2007).
- Kotini, A. G., de Stanchina, E., Themeli, M., Sadelain, M., Papapetrou, E. P. Escape Mutations, Ganciclovir Resistance, and Teratoma Formation in Human iPSCs Expressing an HSVtk Suicide Gene. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 5, e284 (2016).
- Smith, A. J., et al. Apoptotic susceptibility to DNA damage of pluripotent stem cells facilitates pharmacologic purging of teratoma risk. STEM CELLS Translational Medicine. 1 (10), 709-718 (2012).
- Choo, A. B., et al. Selection against undifferentiated human embryonic stem cells by a cytotoxic antibody recognizing podocalyxin-like protein-1. Stem Cells. 26 (6), 1454-1463 (2008).
- Yorke, E., Gelblum, D., Ford, E. Patient safety in external beam radiation therapy. American Journal of Roentgenology. 196 (4), 768-772 (2011).
- Zhou, H., et al. Development of a micro-computed tomography-based image-guided conformal radiotherapy system for small animals. International Journal of Radiation Oncology • Biology • Physics. 78 (1), 297-305 (2010).
- Slatkin, D. N., Spanne, P., Dilmanian, F. A., Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Subacute neuropathological effects of microplanar beams of x-rays from a synchrotron wiggler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (19), 8783-8787 (1995).
- Lee, A. S., et al. Brief Report: External Beam Radiation Therapy for the Treatment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Teratomas. Stem Cells. 35 (8), 1994-2000 (2017).
- Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375 (2), 196-198 (2016).
- Swijnenburg, R. J., et al. In vivo imaging of embryonic stem cells reveals patterns of survival and immune rejection following transplantation. Stem Cells and Development. 17 (6), 1023-1029 (2008).
- Cao, F., et al. Noninvasive de novo imaging of human embryonic stem cell-derived teratoma formation. 암 연구학. 69 (7), 2709-2713 (2009).
- Priddle, H., et al. Bioluminescence imaging of human embryonic stem cells transplanted in vivo in murine and chick models. Cloning and Stem Cells. 11 (2), 259-267 (2009).
- Dale, R. G. Dose-rate effects in targeted radiotherapy. Physics in Medicine & Biology. 41 (10), 1871-1884 (1996).
