Summary

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Published: August 22, 2018
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Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur in Vivo Bestimmung der naiven CD4-T Zellaktivierung (T Cell), Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch GM-CSF Knochenmark (BM)-abgeleitete Dendritische Zellen (DCs). Darüber hinaus beschreibt dieses Protokolls BM und T-Zellen isoliert, DC-Generation und DC und T-Zell-Adoptiv-Transfer.

Abstract

Quantifizierung der naiven CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Differenzierung zu T-Helfer 1 (Th1) Zellen ist eine nützliche Methode, um die Rolle der T-Zellen in einer Immunantwort zu beurteilen. Dieses Protokoll beschreibt die in Vitro Differenzierung von Knochenmark (BM) Stammväter Granulozyten Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) abgeleitet-Dendritische Zellen (DCs) zu erhalten. Das Protokoll beschreibt auch die Adoptiveltern Übertragung von Ovalbumin Peptid (OVAp)-GM-CSF-derived DCs und naive CD4-T-Zellen aus transgenen Mäusen OTII geladen, um die in-Vivo -Aktivierung, Verbreitung und Th1 Differenzierung zu analysieren die übertragenen CD4-T-Zellen. Dieses Protokoll umgeht die Begrenzung der rein in Vivo Methoden durch die Unfähigkeit, speziell zu manipulieren oder wählen die untersuchten Zellpopulation. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokolls Studien in einer in-Vivo -Umgebung, wodurch Veränderungen funktionale Faktoren, die in Vitro auftreten können sowie den Einfluss von Zelltypen und andere Faktoren, die nur in intakten Organe gefunden. Das Protokoll ist ein nützliches Werkzeug zur Erzeugung von Änderungen in DCs und T-Zellen, die adaptive Immunantworten, Bereitstellung von potenziell wichtige Ergebnisse zu verstehen, den Ursprung oder die Entwicklung von zahlreichen damit verbundenen Immunerkrankungen zu ändern.

Introduction

CD4-T-Zellen und antigenpräsentierende Zellen (APCs) wie DCs sind erforderliche Mediatoren der Immunität gegen mikrobiellen Krankheitserregern1,2. In den peripheren lymphatischen Organen werden CD4-T-Zellen bei der Anerkennung der spezifischen Antigene präsentiert von APCs3,4,5aktiviert. Aktivierte CD4-T-Zellen vermehren sich und differenzieren in verschiedene spezifische Th Effektorzellen, die notwendig sind für die Entwicklung eines korrekten adaptiven Immunantwort6,7. Kontrolle dieser Prozesse ist entscheidend für die Herstellung einer angemessenen adaptive Verteidigung, die den Erreger abtötet ohne schädliche Gewebe Schaden8zu produzieren. Th-Zellen werden nach den Ausdruck oder die Produktion von Oberflächenmoleküle, Transkriptionsfaktoren und Effektor Zytokine definiert und wesentliche und präzise Funktionen in Reaktion auf Krankheitserreger1. Zellen der Th1-Zelle Teilmenge Transkriptionsfaktors T-Bet und das Zytokin Interferon-γ (IFNγ) Ausdrücken und in der Wirt Verteidigung gegen intrazelluläre Erreger1teilnehmen. Quantifizierung der naiven CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Differenzierung der Th1 ist ein nützliches Mittel zur Beurteilung der T Zellen Rolle bei einer Immunantwort.

Dieses Protokoll ermöglicht in Vivo Analyse der Leistungsfähigkeit der in Vitro –generiert BM abgeleitet DCs die Aktivierung, Verbreitung und Th1 Differenzierung der naiven CD4-T-Zellen zu modulieren. Das Protokoll dient auch dazu, die Fähigkeit der naiven CD4-T-Zellen aktiviert, induzierte zu vermehren geprüft und Th1 differenziert (Abbildung 1). Dieses vielseitige Protokoll umgeht die Unfähigkeit, speziell zu manipulieren oder die Studium Zellpopulation in rein in Vivo Protokolle auswählen. Die Auswirkungen von unterschiedlichen Molekülen und Behandlungen auf Domänencontrollern können mit BM von genetisch veränderten Mäusen5 oder durch Behandlung oder genetisch manipulieren isoliert BM Zellen9untersucht werden. T-Zell-Antworten können ebenso erkundet werden, durch den Erwerb von T-Zellen für Adoptiv-Transfer aus unterschiedlichen Quellen oder nach mehreren Manipulationen3,8,10.

Die wichtigsten Vorteile dieses Protokolls sind von zweierlei Art. T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Differenzierung der Th1 sind mit einem Flow Cytometry Ansatz analysiert; und dies wird kombiniert mit in Vivo Studien, somit Abwendung Veränderungen, die in Vitro auftreten können sowie Zelltypen und andere Faktoren, die nur in intakten Organe11gefunden.

Die Verwendung von lebenswichtigen Farbstoffen ist eine weit verbreitete Technik, Zellproliferation und vermeiden den Gebrauch von Radioaktivität zu verfolgen. Die Messung der Verbreitung mit dieser Reagenzien basiert auf Farbstoff Verdünnung nach der Zellteilung. Darüber hinaus diese Farbstoffe können bei mehreren Wellenlängen erkannt werden und sind leicht durch Durchflusszytometrie in Kombination mit mehreren fluoreszierende Antikörper oder Marker analysiert. Wir markieren die Nützlichkeit dieses Protokoll zeigt, wie die T-Zellaktivierung, Proliferation und Differenzierung der Th1 durch Durchflusszytometrie analysiert werden können.

Protocol

Experimentelle Verfahren wurden genehmigt durch die Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) und der Comunidad Autónoma de Madrid nach spanischen und europäischen Richtlinien. Mäuse wurden in spezifischen Erreger frei (SPF) Bedingungen gezüchtet und durch Kohlendioxid (CO2) Inhalation eingeschläfert wurden. 1. Isolierung von Knochenmarkzellen Maus aus Gebeinen und Oberschenkelknochen Hinweis: Der C57BL/6 Congenic…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte. Abbildung 2 veranschaulicht die Isolation und die Kultur der BM Mauszellen. Die Zugabe von GM-CSF und LPS zu diesen Kulturen ermöglicht die in-vitro- Erzeugung und Reifung der DCs. Abbildung 3 veranschaulicht die Flow-zytometrie-Analyse der Differenzierung und Reifung der erhaltenen DCs. OVAp geladen GM-CSF BM abgeleitet DCS …

Discussion

Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung der Kapazität der BM-abgeleitete DCs die Aktivierung, Proliferation und Differenzierung von naiven CD4-T-Zellen zu modulieren. Darüber hinaus es auch lässt sich beurteilen, die Anfälligkeit der CD4-T-Zellen zur Modulation von DCs BM abgeleitet. Mit diesem Protokoll kann Änderungen an diesen Veranstaltungen gemessenen in Vivo.

Je nach der Hypothese untersucht können mehrere Kombinationen von T-Zellen und DCs verwendet werden. Zum…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Simon Bartlett für englische Bearbeitung. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse vom Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), Miguel Servet Programm und Fundación Ramón Areces; mit Kofinanzierung von Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Das CNIC wird unterstützt durch das Ministerium für Wirtschaft, Industrie und Wettbewerbsfähigkeit (MEIC) und der Stiftung Pro CNIC und ist ein Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF ist gegründet von Fundación Ramón Areces und CNIC, VZG durch ISCIII, BHF von Instituto de Investigación Sanitaria Krankenhaus 12 de Octubre (imas12) und JMG-G von den ISCIII Miguel Servet Programm und imas12.

Materials

Ethanol VWR Chemicals 20,824,365 5 L
Scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 14001-12
Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11000-13
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11253-20
Scalpel Fine Science Tools (F.S.T.) 10020-00 Box of 100 blades
Fetal Bovine Serum SIGMA F7524
Penicillin/streptomycin LONZA DE17-602E
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) GIBCO 21875-034
Sterile Petri dishes Falcon 353003
25-gauge needle BD Microlance 3 300600
1 ml syringe Novico N15663
15 ml conical tubes Falcon 352096
50 ml conical tubes Falcon 352098
70 μm nylon web filter BD Falcon 352350
Red blood lysis buffer SIGMA R7757 100 Ml
EDTA SIGMA ED2SS-250
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906 100 g
Trypan blue SIGMA 302643-25G
Culture-plates Falcon 353003
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Cambrex BE17-737E
Beta-mercaptoethanol Merck 8-05740-0250
Sodium pyruvate LONZA BE13-115E
L-glutamine LONZA BE17-605E
Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Prepotech 315-03
lipopolysaccharide (LPS) SIGMA-ALDRICH L2018
96-well-plate Costar 3799
v450 anti-mouse CD11b antibody BD Biosciences 560455
PE anti-mouse CD64 antibody BioLegend 139303
PE anti-mouse CD115 antibody BioLegend 135505
FITC anti-mouse CD11c antibody BioLegend 117305
FITC anti-mouse MHCII antibody BioLegend 125507
APC anti-mouse CD86 antibody BioLegend 105011
APC anti-mouse CD80 antibody BioLegend 104713
Flow Cytometry tubes Zelian 300800-1 PS 12X75 5mL
OTII Ovoalbumine peptide InvivoGen 323-339
anti-mouse biotinylated CD8α antibody Tonbo Biosciences 30-0081-U500
anti-mouse biotinylated IgM antibody BioLegend 406503
anti-mouse biotinylated B220 antibody Tonbo Biosciences 30-0452-U500
anti-mouse biotinylated CD19 antibody Tonbo Biosciences 30-0193-U500
anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody BioLegend 115302
anti-mouse biotinylated CD11b antibody Tonbo Biosciences 30-0112-U500
anti-mouse biotinylated CD11c antibody BioLegend 117303
anti-mouse biotinylated CD44 antibody BioLegend 103003
anti-mouse biotinylated CD25 antibody Tonbo Biosciences 30-0251-U100
anti-mouse biotinylated DX5 antibody BioLegend 108903
streptavidin-coated magnetic microbeads MACS Miltenyi Biotec 130-048-101
Magnetic cell separator MACS Miltenyi Biotec 130-090-976 QuadroMACS Separator
Separation columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
PE anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100408
APC anti-mouse CD3 antibody BioLegend 100235
FITC anti-mouse CD8 antibody Tonbo Biosciences 35-0081-U025
Cell Violet Tracer Thermofisher C34557
APC anti-mouse CD25 antibody Tonbo Biosciences 20-0251-U100
Alexa647 anti-mouse CD69 antibody BioLegend 104518
PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 65-0453
APC anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 20-0453
PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 60-0453
FITC anti-mouse CD45.2 antibody Tonbo Biosciences 35-0454
Ionomycin SIGMA-ALDRICH I0634
Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) SIGMA P8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug) BD 555029
Paraformaldehyde Millipore 8-18715-02100
Intracellular permeabilization buffer eBioscience 00-8333
APC anti-mouse IFNg antibody Tonbo Biosciences 20-7311-U100
Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161-U100
B6.SJL CD45.1 mice The Jackson Laboratory 002014
BD LSRFortessa™ Cell Analyzer BD Biosciences 649225
DAPI Solution Thermofisher 62248

References

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Cite This Article
Toribio-Fernandez, R., Zorita, V., Herrero-Fernandez, B., Gonzalez-Granado, J. M. An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (138), e58118, doi:10.3791/58118 (2018).

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