Decellularization do coração humana dentro de uma bolsa pressurizada em uma orientação invertida
Summary
Esse método permite a decellularization de um órgão complexo sólido usando um protocolo simples baseado em choque osmotic e perfusão de detergente iônico com o mínimo de órgão matriz de interrupção. É composto por uma técnica de novela decellularization para corações humanos dentro uma bolsa pressurizada com monitoramento em tempo real da saída de detritos de celular e dinâmica de fluxo.
Abstract
A solução definitiva para pacientes com insuficiência cardíaca de estágio final é o transplante de órgãos. Mas corações doadores são limitadas, imunossupressão é necessária e, finalmente, a rejeição pode ocorrer. Criando um funcional, coração artificial-bio autólogo poderia resolver esses desafios. Biofabrication de um coração composto por células e andaime é uma opção. Um andaime natural com composição de tecido-específica, bem como micro e macroarquitetura pode ser obtido por decellularizing corações de seres humanos ou animais de grandes porte como porcos. Decellularization envolve lavagem restos celulares ao mesmo tempo preservando a vasculatura e 3D da matriz extracelular e permitindo que “celularização” em um Commit depois. Capitalizando sobre nosso romance encontrar aquele decellularization de perfusão de órgãos complexos é possível, nós desenvolvemos um método mais “fisiológico” para decellularize os corações humanos não-transplantáveis, colocando-os dentro de uma bolsa pressurizada, em uma invertida orientação, sob pressão controlada. O propósito de usar uma bolsa pressurizada é criar gradientes de pressão através da válvula aórtica para mantê-lo fechado e melhorar a perfusão do miocárdio. Avaliação simultânea da dinâmica de fluxo e remoção de restos celulares durante decellularization permitida-nos monitorar tanto o fluido influxo e o efluxo de detritos, gerando assim um andaime que pode ser usado também para simples reparação cardíaca (por exemplo, como um patch ou andaime de válvula) ou como um andaime de todo o órgão.
Introduction
Insuficiência cardíaca leva a elevada taxa de mortalidade em pacientes. A opção final tratamento para insuficiência cardíaca de estágio final é allo-transplante. No entanto, há uma longa lista de espera para transplante devido a escassez de órgãos de doador, e rosto de pacientes pós-transplante barreiras que variam de imunossupressão ao longo da vida a rejeição de órgãos crônica1,2. Corações funcionais de bioengenharia pelo repovoamento decellularized corações de tamanho humano, com do próprio paciente células poderiam contornar estes obstáculos3.
Um grande passo em “engenharia” um coração é a criação de um andaime com adequada estrutura vascular e parenquimatosa, composição e função para orientar o alinhamento e organização de células entregues. Na presença de quadro apropriado, células semeadas no andaime devem reconhecer o ambiente e executar a função prevista como parte do órgão. Em nossa opinião, matriz extracelular de órgão decellularized (dECM) compreende as características necessárias de andaime ideal.
Utilizando a vasculatura intrínseca, complexo todo-órgão decellularization pode ser alcançado através de hemorragias anterógradas ou perfusão retrógrada4 para remover componentes celulares preservando o delicado 3D matriz extracelular e vasculatura2, 5,6,7. Uma vasculatura funcional é importante em órgãos inteiros de bioengenharia apenas como na vivo, para a distribuição de nutrientes e remoção de lixo8. Decellularization de perfusão coronariana tem sido provado para ser eficaz na criação de decellularized de corações de ratos4, ou porcos4,7,9,10,11 ,12,13e os seres humanos5,7,14,15,16. Ainda, a integridade das válvulas, átrios e outras regiões “finos” pode sofrer.
Decellularized coração humano-tamanho andaimes podem ser obtidas de porcos usando pressão controle7,9,10,11,12 ou infusão fluxo taxa controle13, 17 e de doadores humanos usando pressão de controle5,7,14,15. Decellularization de corações de doador humano ocorre em 4-8 dias sob pressão controlada em 80-100 mmHg na orientação vertical5,15,16 ou mais de 16 dias sob pressão controlada em 60 mmHg14 . Sob hemorragias anterógradas, decellularization pressão controlada, a competência da valva aórtica desempenha um papel crucial na manutenção da eficiência de perfusão coronariana e pressão estável na raiz da aorta. Nosso trabalho anterior revelou que a orientação do coração influencia sua eficiência de perfusão coronariana durante o procedimento de decellularization e, portanto, a integridade de andaime na final9.
Como uma continuação da nossa anterior trabalho9, apresentamos um novo conceito no qual um malote do pericárdio, como é adicionado para melhorar a decellularization de todo o coração. Descrevemos o decellularization de corações humanos colocadas dentro de bolsas pressurizadas, inversamente orientadas e sob pressão controlada em 120 mmHg na raiz da aorta. Este protocolo inclui o monitoramento do perfil de fluxo e coleção de mídia de saída ao longo do processo de decellularization para avaliar a eficiência de perfusão coronariana e remoção de detritos de células. Ensaios bioquímicos são então realizados para testar a eficácia do método.
Protocol
Representative Results
Discussion
A nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a decellularization relatório invertido de corações humanos dentro uma bolsa pressurizada com lapso de tempo, acompanhamento de remoção de entulhos de taxa e célula de fluxo. A bolsa do pericárdio, como mantém a orientação do coração estável durante todo o processo de decellularization. Submergindo e invertendo os corações inteiro dentro de uma bolsa impede a desidratação e minimiza a tensão excessiva na aorta (a partir de peso do coração) quando compara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo grant Endowment de Houston e o fundo de tecnologia emergente do Texas. Os autores reconhecem a agência de aquisição de órgãos LifeGift, Inc. e as famílias do doador para tornar possível este estudo.
Materials
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
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