파생 및 개 난소 중간 엽 줄기 세포의 분화

요약

여기, 우리가 격리, 확장, 및 개 난소 조직 으로부터 간 엽 줄기 세포의 분화 하는 방법을 설명합니다.

초록

중간 엽 줄기 세포 (MSCs)에 대 한 관심은 절연, 확장, 및 문화의 그들의 용이성으로 인해 지난 10 년간 증가 했다. 최근에, 연구는 이러한 세포 넓은 차별화 용량을 증명 하고있다. MSCs에서 풍부 하 고 생물학 낭비로 ovariectomy 수술 후 자주 취소 됩니다는 사실 때문 난소 세포 기반 치료를 위한 유망한 후보자를 나타냅니다. 이 문서에서는 격리, 확장에 대 한 절차를 설명 합니다 및 MSCs의 세포 분류의 필요성 없이 개 난소에서 파생 된 기술. 이 프로토콜은 임상 시험에서이 매우 구별할 세포의 광범위 한 적용으로 인해 재생 의학에 대 한 중요 한 도구 나타내고 치료 사용.

서론

줄기 세포에 초점 년간 과거, 강력한 재생 의학 치료 발견의 집단 목표에 의해 연료 되었습니다 연구 노력을 실질적으로 증가 했다 출판된 연구의 수입니다. 줄기 세포는 두 개의 기본 정의 마커: 자기 혁신과 차별화. 중간 엽 줄기 세포 정기 조직 회전율에 대 한 책임은 고¹배아 줄기 세포 비해 분화의 보다 제한 된 용량을가지고. 최근에, 많은 연구 다양 한 MSCs의 그리고 논의 중인 주제는 배아 및 성체 줄기 세포 간의 차이점 모든²에 존재 하는 여부.

Ovarium 표면 상피는 커밋되지 않은 세포의 층, 상대적으로 덜 분화, 두 상피와 중간 엽 마커³, 유지 하는 다른 종류의 세포에 대 한 응답에서으로 분화 하는 능력을 표현 하는 환경 신호⁴. 줄기 세포는 난소에서의 정확한 위치는 잘 알려진; 그러나, 그것은 bipotential 창시자 tunica albuginea에서 생식 세포⁵일으키 제안 되었습니다. 이러한 셀 stromal 기원⁶ 또는에 있는 또는 난소 표면

프로토콜

이 실험은 4 개의 잡종 여성 개 개 살 균 프로그램에 선택 수술 후 기증의 난소와 함께 수행 되었다. 이 실험은 UNESP-FCAV (프로토콜 번호 026991/13)의 동물의 사용에 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 실험 준비

1. 준비 하거나 메 마른 Dulbecco 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 칼슘 또는 마그네슘의 500 mL를 구매 합니다.
2. 준비는 콜라 나 DPBS의 1 mL에 효소의 40 µ g을 혼합 하 여 솔루션을 재고. 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 필터링 하 고 저장 2 mL aliquots-20 ° c.에
3. 항생제의 1%와 10% 태아 혈 청 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 낮은 혈당에서 배양을 준비 합니다.
4. 살 균 자료 수집:가 위, 집게, 조직 배양 플라스 크, 요리, 튜브, 그리고 5 mL와 10 mL 펫.
5. 표준 셀 문화 실험실 장비를 사용 하 여: 생물 안전 캐비닛 (BSC), 5% CO₂ 와 38 ° C 원심 분리기에서 설정 셀 문화 인큐베이터.
6. BSC를 청소: 70% 소독 장갑 낀 손으로 EtOH, UV 빛을 사용 하 여.

결과

송곳 니 난소에서 중간 엽 줄기 세포 분리:

난소 MSC 격리 절차는 그림 1에 요약 됩니다. 수술, 조직 닦지, 콜라 소화, 그리고 미디어 변화는 문화의 시작 후 3 h, 후 빠른 플라스틱 접착제 속성 상 상속 MSC 인구는 성공적으로 개 난소 조직 으로부터 격리. 빠르게 수확된 셀 문화 접시의 플라스틱 표면에 준수 하 고 전형적인 MSC와 같은 형태 (그림 3)과 형태학 상으로 균질 단층 문화로 성장 했다.

난소 MSC의 특성

토론

여기 증거 MSCs ovariectomy 후 생물 학적 폐기물 이라고 여겨진다 개 난소 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다 제공 합니다. 사실은 많은 세포 유형 난소에서 찾을 수 있습니다, 우리 구와 같은 형태와 단층에서 성장 하는 셀을 성공적으로 선택, 플라스틱에 그들의 급속 한 준수에 따라 MSCs를 선택 하는 프로토콜을 제안 했다.

골 수에서 MSCs의 파생의 첫 번째 보고서는 문화¹¹;의 첫 번째 48 h 동안 MSCs의 플라스틱 접착 용량에 따라 그러나,이 방법은 이종 인구 phenotypically 및 분리 기능, 적어도 골¹²에 대 한 잠재력을가지고 보고 되었습니다. 제안 된 문화 메서드는 또한 플라스틱 접착 용량으로 셀을 선택 하 고 있는 바람직한 셀 정렬의 필요성 없이 많은 세포 유형, 조직에서 중간 엽 세포를 분리. 사실은 세포 접착⁸.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
디피에스	Thermo Fisher	14190144
Collagenase I	Thermo Fisher	17100017
조직 플라스크	Corning	CLS3056
DMEM 저당	Thermo Fisher	11054020
FBS	Thermo Fisher	12484-010
TrypLE express	Thermo Fisher	12604021
StemPro 지방형성 분화 키트	Thermo Fisher	A1007001
StemPro 연골형성 분화 키트	Thermo Fisher	A1007101
StemPro 골형성 분화 키트	Thermo Fisher	A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit	StemCell	5110
페니실린-스트렙토마이신	Thermo Fisher	15070063
CD45	AbD Serotec	MCA 2035S
CD34	AbD Serotec	MCA 2411GA
CD90	AbD Serotec	MCA 1036G
CD44	AbD Serotec	MCA 1041
Nestin	Milipore	MAB353
β-Tubulin	Milipore	MAB1637
DDX4	Invitrogen	PA5 -23378
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR80F
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR120F