Summary

Dérivation et différenciation des canines ovarienne des cellules souches mésenchymateuses

Published: December 16, 2018
doi:

Summary

Ici, on décrit une méthode pour l’isolation, l’expansion et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses du tissu ovarien canin.

Abstract

Intérêt pour les cellules souches mésenchymateuses (CSM) a augmenté ces dix dernières années en raison de leur facilité d’isolement, l’expansion et la culture. Récemment, des études ont démontré la capacité de différenciation large que ces cellules possèdent. L’ovaire représente un candidat prometteur pour les thérapies à base de cellules due au fait que c’est riche en MSCs et qu’elle est fréquemment ignorée après chirurgies ovariectomie comme un déchet biologique. Cet article décrit les procédures pour l’isolement, l’expansion, et différenciation des MSCs dérivée de l’ovaire canine, sans la nécessité du tri des cellules techniques. Ce protocole représente un outil important pour la médecine régénérative en raison de la large applicabilité de ces cellules fortement différentiables dans les essais cliniques et applications thérapeutiques.

Introduction

Le nombre d’études publiées qui mettant l’accent sur les cellules souches a considérablement augmenté ces dix dernières années, un effort de recherche qui a été alimenté par l’objectif commun de découverte des thérapies de médecine régénérative puissant. Les cellules souches ont deux marqueurs définissant primaires : auto – rénovation et la différenciation. Cellules souches mésenchymateuses sont responsables de chiffre d’affaires de tissu ordinaire et ont une capacité plus restreinte de la différenciation par rapport aux cellules souches embryonnaires1. Récemment, plusieurs études ont montré une large gamme de différenciation de MSCs, et un sujet en discussion est de savoir si il existe des différences entre les cellules souches embryonnaires et adultes à tous les2.

L’épithélium de surface ovarium est une couche non validée de cellules, relativement moins différenciée, qui exprime les deux marqueurs épithéliaux et mésenchymateux3, conservant la capacité de se différencier en différents types de cellules en réponse à signaux environnementaux4. L’emplacement exact des cellules souches dans l’ovaire n’est pas connue ; Toutefois, il a été proposé que bipotential progéniteurs dans l’albuginée donnent naissance à des cellules germinales5. Les études immunologiques ont émis l’hypothèse que ces cellules ont une origine stromales6 ou sont situés dans ou proximale à la surface de l’ovaire7. Étant donné que les cellules souches mésenchymateuses exprimant des récepteurs nombreuses qui jouent un rôle important dans la cellule adhérence8, une expérience a été conçue pour tester l’hypothèse selon laquelle la sélection d’une population de cellules avec adhérence rapide isolerait clairement une population de cellules caractérisable comme mésenchymateuses dans la nature. Récemment, notre groupe a signalé la dérivation de MSCs de tissu ovarien basée sur leur capacité d’adhérence à la surface en plastique de la boîte de Petri pendant les 3 premières heures de la culture, afin d’obtenir une population purifiée de cellules présentant une adhérence rapide9. Nous décrivons ici la méthode développée pour l’isolement de cellules souches mésenchymateuses du tissu ovarien.

Protocol

Cette expérience a été réalisée avec les ovaires de quatre chiennes bâtards donnés après interventions chirurgicales non urgentes à un programme de stérilisation canine. Cette expérience a été approuvée par le Comité d’éthique sur l’utilisation des animaux de UNESP-FCAV (protocole n° 026991/13). 1. préparation expérimentale Préparer ou acheter 500 mL tampon phosphate salin de stérile Dulbecco (SPD) sans calcium ou de magnésium. Préparer une collag…

Representative Results

Isolement de cellules souches mésenchymateuses par ovaire Canine : La technique d’isolation MSC ovarienne est résumée dans la Figure 1. Après chirurgie, tissu hacher, digestion de collagénase et un changement de support 3 h après le début de la culture, une population de MSC putative avec propriétés de plastique adhésif rapides a été avec succès isol…

Discussion

Ci-après nous fournir la preuve que MSCs peuvent être isolés du tissu ovarien canin, qui est considéré comme un déchet biologique après une ovariectomie. Dû au fait que plusieurs types de cellules se trouvent dans l’ovaire, nous avons proposé un protocole pour sélectionner MSCs basés sur leur adhésion rapide au plastique, qui a sélectionné les cellules qui s’est développée en une monocouche avec une morphologie des fibroblastes.

Le premier rapport de la dérivation de MSCs …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le programme de stérilisation canine à UNESP-FCAV pour aimablement les ovaires. Ce travail a été soutenu par des subventions de la FAPESP (processus no 2013/14293-0) et CAPES.

Materials

DPBS  Thermo Fisher 14190144
Collagenase I Thermo Fisher 17100017
Tissue flask Corning CLS3056
DMEM low glucose Thermo Fisher 11054020
FBS Thermo Fisher 12484-010
TrypLE express Thermo Fisher 12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit StemCell 5110
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15070063
CD45 AbD Serotec MCA 2035S
CD34 AbD Serotec MCA 2411GA
CD90 AbD Serotec MCA 1036G
CD44 AbD Serotec MCA 1041
Nestin Milipore MAB353
β-Tubulin  Milipore MAB1637
DDX4 Invitrogen PA5 -23378
IgG- FITC AbD Serotec STAR80F
IgG- FITC AbD Serotec STAR120F

References

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Cite This Article
Hill, A. B., Hill, J. E., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).

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