Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.
Summary
Salmonella spp. /Shigella spp. são patógenos comuns atribuídos a diarreia. Aqui, descrevemos uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp. usando PCR em tempo real combinadas com cultura guiada.
Abstract
Transmissão fecal-oral de gastroenterite aguda ocorre de vez em quando, especialmente quando pessoas que cuidou de comida e água são infectadas por Salmonella spp./Shigella spp. O método padrão-ouro para a detecção de Salmonella spp./Shigella spp. é cultura direta mas é trabalhosa e demorada. Aqui, descrevemos uma plataforma de alto rendimento para Salmonella spp./Shigella spp. triagem, usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) combinada com cultura guiada. Há duas fases principais: a cultura guiada e PCR em tempo real. Para a primeira fase (PCR em tempo real), vamos explicar cada passo do método: coleção, pré-enriquecimento, extração de DNA e PCR em tempo real da amostra. Se o resultado PCR em tempo real é positivo e, em seguida, é realizada a segunda fase (cultura guiada): seletiva cultura, identificação bioquímica e sorológica caracterização. Ilustraremos também resultados representativos gerados a partir dele. O protocolo descrito aqui seria uma plataforma valiosa para a seleção rápida, específica, sensível e elevado-throughput de Salmonella spp. /Shigella spp.
Introduction
Diarreia é ainda um problema de saúde comum com uma incidência elevada taxa globalmente1,2. Embora a mortalidade é relativamente baixa, alguns pacientes apresentam sintomas de várias semanas (por exemplo, solta e aguadas fezes, urgência para ir ao banheiro), que tornam o impacto sócio-econômico muito alta3,4. Mais a sério, alguns pacientes podem desenvolver até mesmo síndrome do intestino irritável se deixados sem tratamento5. Existem vários tipos de bactérias, vírus e parasitas que podem causar diarreia6. Salmonella spp. /Shigella spp. estão entre as bactérias mais comuns para a transmissão de gastroenterite aguda7,8,9,10,11. Portanto, muitos condados emitiram leis ou regulamentos para regular Salmonella spp / triagem deShigella spp. entre as pessoas que iria lidar com comida e água. Por exemplo, o governo chinês emitiu leis para obrigatório Salmonella spp / triagem deShigella spp. uma vez por ano.
O método padrão-ouro para Salmonella spp. / deteção deShigella spp. é a cultura de bactérias. Através de cultura de bactérias e sucessiva identificação bioquímica e sorológica caracterização, podemos identificar as espécies de bactérias, que podem facilitar a gestão do surto de doença e antimicrobiana de perfil para auxiliar o tratamento de pacientes 12. pode também ajudar localizar a fonte de infecção durante a Salmonella spp. /Shigella spp. surto13. No entanto, este método é trabalhosa (que exigem operação manual) e demorado (leva vários dias), especialmente para os testes de um grande número de amostras7. Além disso, viável mas não-viáveis (VBNC) Salmonella spp /pode existir em algumas amostras de fezesdeShigella spp.14. Tendo em conta essas desvantagens, muitos laboratórios tentaram desenvolver novas técnicas para a detecção de Salmonella spp. /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. todos esses métodos usam o teste de amplificação de ácido nuclear (NAAT), entre os quais a reação em cadeia do polymerase (PCR) é o mais comum. Uma grande limitação destes métodos NAAT baseado é que bactérias mortas, detritos mesmo bacteriana contendo incompleta DNA genômico, poderiam mostrar resultados positivos,26, que em grande parte poderia influenciar o diagnóstico preciso da doença. Blanco et al mostrou que aquele ensaio molecular é altamente sensível, não só viável salmonelas nas culturas, mas também para genomas parciais e bactérias mortas ou inviáveis de infecções passadas ou contaminação26. Portanto, a nova tecnologia deve ser desenvolvida.
Aqui, descrevemos um método inovador que combina o NAAT baseado método e cultivo. Como mostrado na Figura 1, este novo método se aplica a PCR em tempo real, triagem primeiro e em seguida as amostras positivas são enviadas para a identificação e a cultura de bactérias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desde Salmonella spp. /Shigella spp. são frequentemente associados com intoxicação alimentar e transmissão fecal-oral de gastroenterite aguda28,29 , e o método de rotina é trabalhoso ou demorado 7, nós descrevemos uma plataforma de alta produtividade para a Salmonella spp. / rastreio deShigella spp., usando PCR em tempo real combinadas com cultura guiada.
Há várias et…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela ciência e tecnologia programa de Zhuhai, China (número de concessão de 20171009E030064), a ciência e tecnologia programa de Guangdong, China (número de concessão de 2015A020211004) e da ciência e tecnologia-programa de administração geral Supervisão da qualidade, inspeção e quarentena da República Popular da China (número de concessão de 2016IK302, 2017IK224).
Materials
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
| Nutrient Broth | LandBridge | CM106 | |
| Nutrient agar | LandBridge | CM107 | |
| Selenite Cystine medium | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella chromogenic agar | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella diagnostic serum | Tianrun | SAL60 | |
| Shigella diagnostic serum | Tianrun | SHI54 | |
| anal swab (collecting tube plus) | Huachenyang | ||
| slide | Mingsheng | 7102 | |
| micro-loop | Weierkang | W511 | |
| incubator | Jinghong | DNP-9082 | |
| autoclave | AUL | SS-325 | |
| dry bath | Jinghong | KB-20 | |
| automated microbial identification system | bioMérieux | VITEK2 | other equivalent system could be used |
| fluorescent real-time PCR machine | ThermoFisher | ABI7500 | other equivalent machine could be used |
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