En hög genomströmning plattform för Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.
Summary
Salmonella spp. /Shigella spp. är vanliga patogener tillskrivs diarré. Här, vi beskriver en hög genomströmning plattform för screening av Salmonella spp. /Shigella spp. med realtids-PCR kombinerat med guidade kultur.
Abstract
Fekal-oral överföring av akut gastroenterit förekommer emellanåt, särskilt när människor som hanterade mat och vatten är smittade av Salmonella spp./Shigella spp. Den gyllene standard metoden för detektion av Salmonella spp./Shigella spp. är direkt kultur men det är arbetskrävande och tidsödande. Här beskriver vi en hög genomströmning plattform för Salmonella spp./Shigella spp. screening, med realtid polymeras-kedjereaktion (PCR) i kombination med guidade kultur. Det finns två huvudfaser: realtids-PCR och guidade kultur. För den första etappen (realtids-PCR), vi förklarar varje steg i metoden: prova samling, före berikning, DNA-extraktion och realtids-PCR. Om realtids PCR resultatet är positivt, då det andra steget (guidade kultur) utförs: selektiv kultur, biokemisk identifikation och serologiska karakterisering. Vi illustrerar också representativa resultat genereras från den. Protokollet beskrivs här skulle vara en värdefull plattform för snabb, särskilda, känsliga och high-throughput screening av Salmonella spp. /Shigella spp.
Introduction
Diarré är fortfarande ett vanligt hälsoproblem med hög incidens Betygsätt globalt1,2. Även dödligheten är relativt låg, vissa patienter uppvisar olika symtom i veckor (såsom lös och vattnig avföring, en brådska att gå på toaletten), som gör de samhällsekonomiska konsekvenser mycket hög3,4. Mer allvarligt, vissa patienter kan även utveckla colon irritabile om de lämnas obehandlade5. Det finns olika typer av bakterier, virus och parasiter som kan orsaka diarré6. Salmonella spp. /Shigella spp. är bland de vanligaste bakterierna för överföring av akut gastroenterit7,8,9,10,11. Därför många län har utfärdat lagar eller bestämmelser för regelbundna Salmonella spp. /Shigella spp. screening bland människor som skulle hantera mat och vatten. Till exempel den kinesiska regeringen har utfärdat lagar för obligatorisk Salmonella spp. /Shigella spp. screening en gång om året.
Metoden guldmyntfoten för Salmonella spp. /Shigella spp. upptäckt är bakterier kultur. Genom bakterier kultur och successiva biokemiska identifiering och serologiska karakterisering, kan vi identifiera arterna av bakterier, som kunde underlätta utbrottet sjukdomshantering och antimikrobiella profilering för att underlätta behandling av patienter 12. det kan också hjälpa spåra smittkällan under den Salmonella spp. /Shigella spp. utbrott13. Denna metod är dock arbetsintensiva (som kräver manuell drift) och tidskrävande (tar flera dagar), särskilt för testning av ett stort antal prover7. Dessutom lönsamt men icke-odlingsbara (VBNC) Salmonella spp. /Shigella spp.kan förekomma i vissa avföringsprov14. Med tanke på dessa nackdelar, många laboratorier har försökt att utveckla ny teknik för detektion av Salmonella spp. /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. alla dessa metoder använder kärnkraft acid amplification testet (Norling), bland vilka polymeras-kedjereaktion (PCR) är den vanligaste. En stor begränsning av dessa NAAT baserade metoder är att döda bakterier, även bakteriell skräp som innehåller ofullständiga genomiskt DNA, kunde visa positiva resultat26, som till stor del kan påverka korrekt diagnos av sjukdom. Blanco et al. visade att molekylär analys är mycket känsliga, inte bara lönsamt Salmonella i kulturer, men också att partiell genomen och olönsamma eller döda bakterier från tidigare infektioner eller kontaminering26. Ny teknik bör därför utarbetas.
Här, beskrivit vi ett nya metoden att kombinerar NAAT metod och odling. Som visas i figur 1, denna nya metod gäller realtids-PCR screening först och sedan positiva prover skickas för bakterier kultur och identifiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sedan Salmonella spp. /Shigella spp. förknippas ofta med matförgiftning och fekal-oral överföring av akut gastroenterit28,29 och rutinmetoden är antingen arbetsintensiva eller tidskrävande 7, beskriver vi en hög genomströmning plattform efter Salmonella spp. /Shigella spp. screening, med realtids-PCR kombinerat med guidade kultur.
I området i närheten finns det flera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av vetenskapen och teknik programmet i Zhuhai, Kina (grant nummer 20171009E030064), vetenskapen och teknik programmet av Guangdong, Kina (grant nummer 2015A020211004) och vetenskap och teknik programmet av allmän Administration av Quality Supervision, Inspection and Quarantine av folkets republik av Kina (grant nummer 2016IK302, 2017IK224).
Materials
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
| Nutrient Broth | LandBridge | CM106 | |
| Nutrient agar | LandBridge | CM107 | |
| Selenite Cystine medium | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella chromogenic agar | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella diagnostic serum | Tianrun | SAL60 | |
| Shigella diagnostic serum | Tianrun | SHI54 | |
| anal swab (collecting tube plus) | Huachenyang | ||
| slide | Mingsheng | 7102 | |
| micro-loop | Weierkang | W511 | |
| incubator | Jinghong | DNP-9082 | |
| autoclave | AUL | SS-325 | |
| dry bath | Jinghong | KB-20 | |
| automated microbial identification system | bioMérieux | VITEK2 | other equivalent system could be used |
| fluorescent real-time PCR machine | ThermoFisher | ABI7500 | other equivalent machine could be used |
References
- Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, 31-69 (2006).
- Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
- Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
- Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
- Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
- Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
- Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
- Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
- Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
- Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact–United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
- Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
- Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
- Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, 93-100 (2005).
- Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
- Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
- Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
- Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
- Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
- Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
- Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
- Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
- Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
- Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
- Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
- Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
- Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
- Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana–salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
- Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water – United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
- Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
- Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
- Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
- Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
- Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).
