선물이 2 광자 현미경은 micropipette 쥐, 보 먼의 요도 공간 배치의 사용의 신장 생리학의 2 기초 기술을 결합. 2 광자 현미경의 사용 micropuncture 신장 생리학 연구에 대 한 기존의 현미경의 중요 한 한계를 극복 한다.
신장 micropuncture 및 신장 2 광자 이미징 신장 생리학 정액 기술이 있습니다. 그러나, micropuncture은 기존의 현미경 표면 nephron 기능에 대 한 의존에 의해 제한 및 2 광자 연구는 제한 개입만 nephron 수준 보다는 기관에서 평가 될 수 있다. 특히, 쥐의 glomeruli의 micropuncture 연구 생쥐에서 표면 glomeruli의 소수에 의해 도전을 받고 있다. 해결 하기 위해이 제한 마우스 생리 모델에서 보 먼의 공간에서 aspirate의 연구를 추구 하기 위하여, 우리는 2 광자 사 micropuncture 개발. 선물이 2 광자 현미경 검사 법에 대 한 필요한 수직 이미지 열을 유지 하면서 신장에 측면 액세스할 수 있는 새로운 수술 준비. 높은 분자량 fluorescein isothiocyanate (FITC) 관리-dextran 신장 맥 관 구조 및 그러므로 glomeruli 2 광자 영상에 대 한 표시를 렌더링 하는 데 사용 됩니다. 양자 점 코팅 피 펫 다음 정위 적 지도 하에 있는 많은 여러 이미징 창 내에서 시각화 수 있습니다에서 선택한 glomerulus 소개 했다. 이 프로토콜의 준비, 재료 및 방법 절차를 수행 하는 데 필요한 세부 사항을 제공 합니다. 이 기술은 보 먼의 공간에서 여과 액의 복구 및 이미징 깊이 제한, 신장 캡슐 아래 약 100 µ m 내 nephron의 모든 세그먼트를 포함 하 여 신장, 이전 불가능 한 생리 연구를 촉진 한다. 압력, 충전 및 흐름 수 있습니다 모든 측정 도입된 피 펫을 사용 하 여. 여기, 우리는 보 우먼의 공간에서 aspirate에 수행 하는 액체 크로마토그래피/질량 분석에서 대표 데이터를 제공 합니다. 우리는이 기술을 신장 생리 조사에 있는 넓은 적용을 기대 합니다.
이 절차의 목적은 일상적인 micropuncture 액세스 보 먼의 공간 및 쥐에 다른 사 구조를 제공 하는 것 이다. 신장 생리학에 대 한 Micropuncture 연구 1-광자 현미경 검사 법,이 수만 내에 신장 표면의 몇 미크론 이미지와 z 차원에서 제한 된 정밀도 제공 하 게 제한 되었다. 쥐 몇 표면 glomeruli 있기 때문에, 그것은 항상 1-광자 현미경으로 표면 glomerulus 찾을 수, 따라서 대부분의 micropuncture 연구는에서 실시 되었습니다 더 많은 표면 glomeruli 있는 뮌헨 Wistar 쥐. 따라서, 마우스 모델에서 작업의 장점 micropuncture 연구1,2,3에 제한 되었습니다. 이미징 기술, 마이크로-CT4,5를 포함 하 여 최근 발전 나노 이미징6및7 질량 분석 이미징 형식 사 생리학에 적용의 범위 향상 크게 하지만 대신할 독특한 남아 능력을 개입 하 고 그 micropuncture 샘플을 제공 합니다. 따라서 여기에 제시 된 기술을 사용 하 여 micropuncture 사용 하 여 확장 소설 신장 생리학 연구, 특히, 신장 여과 액 (즉, metabolomics)의 내용과의 기본적인 생리학의 평가 촉진 예정 이다 이전 filtrate 압력 및 충전, 측정 등의 유전자 변형 쥐 쥐에만 수행합니다.
이 기술에서는, 2 광자 현미경 사용 신장 캡슐 아래 시각화 및 약 100 µ m까지 신장 구조 micropipette 액세스 수 있습니다. 여러 (5-10) glomeruli 따라서 지금까지 몇 군데 모든 마우스 신장에서 micropuncture에 액세스할 수 있습니다. 기존의 신장 micropuncture와 일부 기능을 공유 하는이 기술을, 비록 그것은 디자인된 드 노 보 고 기존의 기술에서 광범위 한 수정 필요 합니다. 이 프로토콜에서 우리 보 먼의 공간에서 액체의 포부를 설명 하 고 질량 분석 (nanoproteomics)8,9,,1011이후 분석의 결과 예를 보여. 질량 분석의 다운스트림 사용 여기 시연 또한 특수 샘플 준비 워크플로를 필요 합니다.
우리는 비 표면 glomeruli 쥐, 2 광자 현미경 검사 법에 의해 촉진 된의 보 먼의 공간에 액세스 하는 방법을 제시. 우리는 실험 목적, 보 먼의 공간에서 액체의 포부를 촉진 하기 위하여 사 micropuncture, 표면 glomeruli 생쥐, 1-광자 현미경으로 주소 지정이 가능한 희귀의 키 제한을 해결 하기 위해이 절차를 개발 이후 분석입니다. 개발 및이 기술의 연습 6 개 중요 한 단계에 달려있다. 첫째, 새로운 수술 준비 해야 신중 하 게 실시 이미징 물 열은 coverslip에서 실행 되지 않습니다 하 고는 coverslip 피펫으로의 대상인 신장의 영역 확장. 둘째, micropuncture에 사용 되는 유리 피 펫 2 광자 현미경, 양자 점을 사용 하 여 수행 됩니다에 대 한 표시 렌더링 되어야 합니다. 셋째, 정위 적 기술은 신장 표면 아래 100 µ m까지 3 차원에서 보 먼의 공간에는 피 펫을 정확 하 게 위치 해야 합니다. 따라서 중요 한 단계는 정밀 피펫으로 무대의 좌표 시스템에 등록. 대상 glomerulus의 4, 주의 선택은 신장 지원 구조 및 이미징 열에 의해 충돌 없이 피 펫에 액세스할 수 있도록 해야 합니다. 마지막으로, 인수 절차에 따라 심사 분석 단계를 부여 해야 합니다 하 고 분석 하 고 사 생리학 볼륨 및 액체 샘플의 취득 시기를 일치 해야 합니다.
우리는 많은 분석, 불꽃 광도, 민감한 이온 전극 측정, 압력, 볼륨 또는 충전의 측정 등 전통적인 micropuncture 끝점을 포함 하 여 연장 될 수 있습니다 인수 절차를 설계. 또한, 우리는이 기술을 소설 분석 끝점 연쇄 반응 (아마도 다음 miRNA에 대 한 반전 녹음 방송) 등 하류 질량 분석의 대사체학 의무가 있을 것입니다 믿습니다. 질량 분석을 촉진 하기 위하여 고용 하는 특별 한 수정 추가 논의 받을 자격이 그리고 그들은 몇 가지 한계를 부과. 첫째, 질량 분석은 매우 중요 한, 낮은 단백질 콘텐츠 및 micropuncture 샘플의 볼륨 렌더링 기존의 proteomic 탐사의 동적 범위는 단백질의 분석 했으며 따라서 단순화 된 nanoproteomics 필요한. 8 , 13 둘째, 최적화 하려면 초기 분석에 대 한 단백질 수확량, 우리 결정 aspirate의 200-300 nL 필요 하다 하지만 마우스 GFR은 8-14 nL만 하는 경우이 볼륨의 de novo filtrate 수집 포부의 20 분 아마도 오래 필요한 것 /min3. 우리 6 분 이상; 발음 선출 같이 도조 및 Endou 장기간된 포부 초기 근 관 유체14의 알 부 민 콘텐츠 변경, 그러나 우리의 포부 속도 filtrate 유입 속도 초과 하는 것이 즉. 이 절차의 사용자는 그들의 워크플로 설계에 그들의 실험 시스템에 사 여과의 생리를 고려 하도록 권장 된다. 질량 분석, 중요 한 기술, 광 유, 열망에 대 한 유압 시스템을 구성 하는 nephron의 세그먼트를 격리 micropuncture에서 일반적으로 사용 되는 등 도입된 석유 유출 물에서 신호에 의해 압도 것 이다. 따라서, 우리는이 목적을 위해 미네랄 오일 사용 하지 수 또는 그것의 다른 일반적인 사용, nanoliter 범위 샘플의 볼륨의 정량화. 대신 우리가 채울 시스템 생물학적으로 불활성, 질량 분석을 방해 하지 않습니다 이며 유리한 광학 특성이 있다 perfluorodecalin. 우리는 perfluorodecalin에 의해 부과 된 한계 극복할 수 있으며, 우리가 기대 하는 샘플 볼륨의 측정 및 봉쇄 관 세그먼트의 추가 기술 혁신에 노력 하 고 믿습니다.
대부분의 micropuncture 연구 뮌헨 Wistar 쥐, 근본적인의 손실이 증가 수가 표면 glomeruli, 하지만 관 전송 및 다른 신장 생리학이 크게 제한 된 생리 연구를 설명 하는에서 수행 되었습니다. 분자 생물학, 유전자 변형 마우스2,3의 도구입니다. 쥐에서 보 먼의 공간 micropipette 액세스 용이 그것 때문에 소설 기법을 따라서 이러한 중요 한 제한 완화 합니다. 우리 신장 filtrate proteomic 연구 nanoproteomics9로 알려진 높은 감도 질량 분석을 사용 하 여 액세스 하기 위해이 기술을 채택. 그러나, 아마 추가 응용 프로그램 있다. 예를 들어 필터링 된 단백질의 신장 생리 연구는 되었습니다 크게 주 었 형광 추적기를 사용 하 여 2 광자 현미경15,,1617. Micropuncture 2-광자 현미경 하의 추가 형광 분자로, 이웃, 비 주사 nephrons 컨트롤 역할을 수 있도록 단일 nephron 생리 연구 수행의 가능성을 제공 합니다. 그것은 필요한 조치의 명확한 설명이 이미 2 광자 현미경 및 micropuncture 장착 하는 실험실에서 광범위 한 채택 수 기대. 그것은 복잡 한, 비록 우리 지금 여러 번이이 절차를 수행 했습니다 하 고 여기에 소개 하는 상세 생리 발견을 위한 안정적인 플랫폼을 나타냅니다.
The authors have nothing to disclose.
NIDDK K08 RDS에 MPH NIGMS P41 GM103493 DK090754. 이 자료는 자원으로 지원 되었다 (MPH)에 의해 작업의 결과 이며 포틀랜드 노 병 사변 의료 센터에 시설 사용. 내용을 미국 재향 군인 담당 부서 또는 미국 정부의 의견을 대표 하지 않는다.
Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
Microinjector | WPI | UMP-3 | |
Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
30 gauge needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |