استخدام أوتوميتالوجرافي لتعريب والتحديد الكمي لشبه الفضة في الأنسجة الحيتانيات
Summary
بروتوكول قدمه لتعريب Ag في أنسجة الكبد والكلى الحيتانيات أوتوميتالوجرافي. وعلاوة على ذلك، أعد مقايسة جديدة، تسمى المقايسة Ag النسيجي الحيتانيات (شا) لتقدير تركيزات Ag في تلك الأنسجة.
Abstract
جسيمات فضة نانوية (أجنبس) وقد استخدمت على نطاق واسع في المنتجات التجارية، بما في ذلك المنسوجات ومستحضرات التجميل، وعناصر الرعاية الصحية، بسبب آثارها الميكروبات قوية. كما أنها قد تطلق في البيئة وتتراكم في المحيط. ولذلك، أجنبس هي المصدر الرئيسي لتلوث Ag، وهو زيادة وعي الجمهور بالسمية البيئية ل Ag. أظهرت الدراسات السابقة على التراكم الأحيائي (بالمنتجين) والتكبير (في المستهلكين/الحيوانات المفترسة) من Ag. الحيتانيات، كالحيوانات المفترسة ابيكس للمحيطات، ربما قد تأثرت سلبا بمركبات Ag/Ag. على الرغم من أن يمكن قياس تركيزات مركبات Ag/Ag في الأنسجة الحيتانيات ببلازما الحث يقترن التحليل الطيفي الشامل (برنامج المقارنات الدولية–مرض التصلب العصبي المتعدد)، يقتصر استخدام برنامج المقارنات الدولية–مرض التصلب العصبي المتعدد ارتفاع تكلفة رأس المال والحاجة إلى تخزين الأنسجة والتحضير. ولذلك، أوتوميتالوجرافي (AMG) أسلوب مع تحليل كمي صورة باستخدام الفورمالين–الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين الأنسجة (فب) قد يكون أسلوب adjuvant لتوطين Ag التوزيع على مستوى سبورجن وتقدير تركيز Ag في للحيتانيات الأنسجة. إشارات إيجابية AMG أساسا البنى إلى حبيبات سوداء من مختلف الأحجام في السيتوبلازم من ظهارة الأنبوبي الكلوي الدانية، وخلايا الكبد، وخلايا كوبفر. في بعض الأحيان، تتم الإشارة إلى بعض غير متبلور أصفر ذهبي إلى بني AMG إشارات إيجابية في التجويف والغشاء من بعض الكلوية الدانية. الفحص لتقدير تركيز Ag يدعى للحيتانيات النسيجي Ag المقايسة (شا)، ونموذج انحدار المنشأة بالبيانات من صورة التحليل الكمي لأسلوب AMG وبرنامج المقارنات الدولية–مرض التصلب العصبي المتعدد. ويوفر استخدام AMG مع شا إلى ترجمة وشبه قياس المعادن الثقيلة منهجية ملائمة للدراسات الزمانية والصليب-الأنواع.
Introduction
جسيمات فضة نانوية (أجنبس) وقد استخدمت على نطاق واسع في منتجات تجارية، بما في ذلك المنسوجات ومستحضرات التجميل، وعناصر الرعاية الصحية، بسبب ما آثار مضادات الميكروبات كبيرة1،2. لذلك، يتم زيادة إنتاج أجنبس والعدد من المنتجات المحتوية على عنب على مر الوقت3،4. ومع ذلك، أجنبس قد تطلق في البيئة وتتراكم في5،المحيط6. فقد أصبحت مصدرا رئيسيا للتلوث Ag، وهي زيادة الوعي العام بالسمية البيئية ل Ag.
مركز أجنبس و Ag في البيئة البحرية المعقد والمتغير باستمرار. أشارت الدراسات السابقة إلى أن أجنبس يمكن أن تبقى الجسيمات، التجميعية، حل، وتتفاعل مع مختلف الأنواع الكيميائية، أو يمكن إعادة إنشائها من أيونات Ag+ 7،8. قد تم العثور على عدة أنواع من المركبات Ag، مثل أجكل، في الرواسب البحرية، حيث يمكن بلعها من الكائنات القاعية وأدخل9،السلسلة الغذائية10. ووفقا لدراسة سابقة أجريت في منطقة البحيرة كو تشي على طول الساحل الجنوبي الغربي لتايوان، Ag تركيزات الرواسب البحرية منخفضة للغاية وشبيه الوفرة في القشرة الأرضية، وتلك من أنسجة الأسماك الكبد عادة دون الكشف عن الحد (< 0.025 ميكروغرام/غرام رطب/رطب)11. ومع ذلك، أظهرت دراسات سابقة أجريت في بلدان مختلفة Ag تركيزات عالية نسبيا في الكبد من الحيتانيات12،13. تركيز Ag في الكبد من الحيتان تعتمد على العمر، مما يوحي بأن مصدر Ag في أجسادهم على الأرجح على فريسة12. وتوحي هذه النتائج زيادة التضخم أحيائي Ag في الحيوانات عند المستويات التغذوية. الحيتانيات، المفترسات العليا في المحيط، وقد عانت من الآثار الصحية السلبية الناجمة عن Ag/Ag مركبات12،،من1314. الأهم من ذلك، أن البشر هم مثل الحيتان، الثدييات، والصحية السلبية التي قد تحدث التأثيرات الناجمة عن المركبات Ag/Ag في الحيتانيات في البشر. وبعبارة أخرى، يمكن أن تكون الحيتان الحيوانات الحارس على صحة البشر والبيئة البحرية. ولذلك، الآثار الصحية، وتوزيع الأنسجة، وتركيز Ag في الحيتانيات مصدر قلق كبير.
على الرغم من أن يمكن قياس تركيزات مركبات Ag/Ag في الأنسجة الحيتانيات ببلازما الحث يقترن التحليل الطيفي الشامل (برنامج المقارنات الدولية–مرض التصلب العصبي المتعدد)، استخدام برنامج المقارنات الدولية–مرض التصلب العصبي المتعدد هو محدودة بارتفاع تكاليفه الرأسمالية (الصك والصيانة) ومتطلبات تخزين الأنسجة /preparation،من1215. وبالإضافة إلى ذلك، من الصعب عادة لجمع عينات الأنسجة شاملة في جميع التحقيقات في حالات الحيتانيات الذين تقطعت بهم السبل بسبب الصعوبات اللوجستية، ونقص في القوى العاملة، والافتقار إلى الموارد ذات الصلة12. لا يتم تخزين عينات الأنسجة المجمدة لتحليل برنامج المقارنات الدولية–مرض التصلب العصبي المتعدد بسهولة بسبب المساحة المحدودة التبريد، وقد يتم تجاهل عينات الأنسجة المجمدة بسبب معدات التبريد كسر12. هذه العقبات السالفة الذكر تعيق التحقيقات المتعلقة بمستويات التلوث في الأنسجة الحيتانيات بتحليل برنامج المقارنات الدولية–مرض التصلب العصبي المتعدد باستخدام عينات الأنسجة المجمدة. وفي المقابل، الفورمالين الثابتة عينات الأنسجة سهلة نسبيا لجمع خلال نيكروبسي الحيتانيات الموتى-الذين تقطعت بهم السبل. ولذلك، من الضروري تطوير طريقة سهلة وغير مكلفة الكشف عن/قياس المعادن الثقيلة في أنسجة الحيتانيات باستخدام الفورمالين الثابتة عينات الأنسجة.
على الرغم من أن يغير توزيعات سبورجن وتركيزات الفلزات القلوية والقلوية الأرض خلال الفورمالين–الثابتة، كانت جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) عملية، إلا أقل آثار المعادن الانتقالية، مثل مجموعة أستراليا، أشار إلى16. ومن ثم، كانت تعتبر الأنسجة FFPE موردا عينة مثالية للتعريب معدنية وقياسات16،17. يمكن تضخيم أوتوميتالوجرافي (AMG)، عملية histochemical، والمعادن الثقيلة العارضة الحجم أصفر ذهبي إلى أسود AMG إشارات إيجابية في أقسام الأنسجة FFPE، ويمكن تصور هذه المعادن الثقيلة مكبرة تحت المجهر الخفيفة18، 19 , 20 , 21-ومن ثم فأسلوب AMG ويقدم معلومات عن التوزيعات سبورجن من المعادن الثقيلة. أنها يمكن أن توفر معلومات إضافية هامة لدراسة المسارات الأيضية للمعادن الثقيلة في النظم البيولوجية لبرنامج المقارنات الدولية-MS فقط يمكن قياس تركيز المعادن الثقيلة في الجهاز مستوى18. وعلاوة على ذلك، طبق البرنامج تحليل الصور الرقمية، مثل إيماجيج، للتحليل الكمي لانسجة النسيجي المقاطع22،23. أصفر ذهبي الحجم مغايرة للأسود AMG إشارات إيجابية من أقسام الأنسجة FFPE يمكن قياسها كمياً والمستخدمة لتقدير تركيزات المعادن الثقيلة. رغم أنه لا يمكن تحديد تركيز Ag المطلق مباشرة بواسطة الأسلوب AMG مع التحليل الكمي الصورة، يمكن تقدير من نموذج انحدار استناداً إلى البيانات التي تم الحصول عليها من التحليل الكمي الصورة وبرنامج المقارنات الدولية–مرض التصلب العصبي المتعدد، يدعى للحيتانيات النسيجي المقايسة Ag (شا). وبالنظر إلى الصعوبات في قياس تركيزات Ag بتحليل برنامج المقارنات الدولية–مرض التصلب العصبي المتعدد في الحيتان أكثر الذين تقطعت بهم السبل، شا هو أسلوب adjuvant قيماً لتقدير Ag التركيزات في الأنسجة الحيتانيات، والتي لا يمكن أن يتحدد بتحليل برنامج المقارنات الدولية–مرض التصلب العصبي المتعدد بسبب الافتقار إلى تجميد عينات الأنسجة. وتصف هذه الورقة بروتوكول تقنية histochemical (أسلوب AMG) لإضفاء الطابع المحلي Ag على مستوى سبورجن والانزيم المسمى شا لتقدير تركيزات Ag في أنسجة الكبد والكلى للحيتان.
رقم 1: مخطط انسيابي تصور إنشاء وتطبيق من الحيتانيات النسيجي Ag المقايسة (شا) لتقدير تركيزات Ag- شا = الحيتانيات المقايسة Ag النسيجي، فب = الفورمالين ثابتة، وجزءاً لا يتجزأ البارافين، برنامج المقارنات الدولية-MS = بلازما الحث يقترن الشامل التحليل الطيفي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Protocol
Representative Results
Discussion
والغرض من هذه الدراسة المادة إنشاء أسلوب adjuvant لتقييم التوزيع Ag على الصعيدين سبورجن وتقدير Ag التركيزات في الأنسجة الحيتانيات. تتضمن البروتوكولات الحالية 1) تحديد Ag التركيزات في الأنسجة الحيتانيات ببرنامج المقارنات الدولية–مرض التصلب العصبي المتعدد، 2) AMG تحليل عينات الأنسجة زوج متطابق مع …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر “شبكة شتت للحيتانيات تايوان” لجمع العينات، والتخزين، بما في ذلك “المجتمع للحيتانيات تايوان”، تايبي؛ مختبر بحوث الحيتانيات (الأستاذ سيانغ ليان تشو)، معهد علم البيئة وعلم الأحياء التطوري، جامعة تايوان الوطنية، تايبيه؛ المتحف الوطني للعلوم الطبيعية (الدكتور ياو شيو-جو)، تايشونج؛ وعلم الأحياء البحرية & للحيتانيات مركز البحوث، جامعة تشينغ كونغ الوطنية. ونشكر أيضا مكتب الغابات، ومجلس الزراعة، اليوان التنفيذي للحصول على تصريح.
Materials
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | — | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
References
- McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
- Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).
- Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers?. Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).
- Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
- Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).
- Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).
- Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).
- Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).
- Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).
- Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
- Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).
- Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. , 534-545 (2018).
- Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).
- Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. , (2018).
- Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).
- Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).
- Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).
- Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).
- Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).
- Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).
- Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).
- Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92 (2013).
- Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46 (2016).
- Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. , 167-230 (2005).
- Shih, C. -. C., Liu, L. -. L., Chen, M. -. H., Wang, W. -. H. . Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. , (2001).
- Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
- Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6 (2010).
- Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).
- Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).
- Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).
- Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).
