Real Time In Vivo suivi des Thymocytes dans la chambre antérieure de le œil par microscopie à balayage Laser
Summary
L’objectif du protocole est de montrer longitudinale intravitale suivi en temps réel des thymocytes par laser, microscopie dans les implants du thymus dans la chambre antérieure de l’oeil de la souris. La transparence de la cornée et la vascularisation du greffon permettant pour l’enregistrement en continu de recrutement de cellules progénitrices et évacuation des lymphocytes mature.
Abstract
L’objectif de la méthode présentée est de montrer, pour la première fois, la greffe du nouveau-né thymi dans le compartiment antérieur de le œil de souris adultes isogéniques pour in vivo longitudinal suivi en temps réel de thymocytes´ dynamique dans un vascularisé segment du thymus. Après la transplantation, laser, microscopie (LSM) à travers la cornée permet en vivo imagerie répétés non invasive au niveau cellulaire de la résolution. Ce qui est important, l’approche ajoute au précédente maturation des lymphocytes intravitale imagerie modèles la possibilité pour le recrutement de cellules progénitrices continu et enregistrements de sortie lymphocytes matures chez le même animal. Avantages supplémentaires du système sont la transparence de la zone greffée, permettant une surveillance rapide macroscopique des tissus implantés, et l’accessibilité à l’implant permettant localisés en plus de traitements systémiques. La principale limite est le volume du tissu qui s’inscrit dans l’espace réduit de la chambre de le œil qui exige pour que la suppression du lobe. Intégrité de l’organe est maximisée en disséquant des lobes de thymus chez les patrons déjà montrés pour être fonctionnel pour la production de lymphocytes T mature. La technique est potentiellement adaptée pour interroger un milieu de médicalement des questions liées à la fonction du thymus qui incluent l’auto-immunité, l’immunodéficience et tolérance centrale ; processus qui restent mécaniquement mal définis. La dissection fine des mécanismes guidant la sélection, la différenciation et la migration des thymocytes devrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les cellules T en développement.
Introduction
Intrathymique différenciation des lymphocytes T et sélection de sous-populations de lymphocytes T constituent des processus clés pour le développement et le maintien de l’immunité à médiation cellulaire dans les vertébrés1. Ce processus implique une séquence complexe d’événements étroitement organisés y compris le recrutement des progéniteurs de circulation sanguine, la prolifération cellulaire et migration, expression différentielle des protéines membranaires et la mort cellulaire programmée massives pour des sous-ensembles sélection. Le résultat est la libération des lymphocytes T matures réactives à un ample spectre d’antigènes étrangers tout en affichant les réponses réduites aux auto-peptides, dont fin-up coloniser les organes lymphoïdes périphériques des individuels2,3. Sélection de thymocytes aberrante du répertoire αβTCR mène à une maladie auto-immune ou de déséquilibre immunitaire4 qui dérivent principalement de défauts au cours du processus de sélection positive ou négative précurseur, respectivement.
Migration directionnelle des thymocytes dans le thymus est inhérente à tous les stades de la maturation des lymphocytes T et il est envisagé comme une série de simultanée ou séquentielle des stimuli multiples, y compris les chimiokines, adhésif, et colle la matrice extracellulaire (ECM) interactions de protéine3,5. L’étude des tissus fixés a rendu les informations essentielles concernant les modes d’expression pour les piles migrateurs thymocyte microenvironnements thymique défini5,6, tandis que des études ex vivo a révélé deux répandu les comportements migratoires des thymocytes dans deux zones distinctes sur le plan histologique de l’organe : ralentir les mouvements stochastiques dans le cortex et la motilité rapide, confinée dans le bulbe rachidien7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. augmentation taux migratoires sont en corrélation avec la sélection positive du thymus13 et une sélection négative est associé au comportement rampant supporte l’hypothèse que la cinétique du voyage à travers le thymus détermine propre maturation des thymocytes. Malgré leur importance, la topologie des interactions entre les cellules stromales-thymocyte et la dynamique de la motilité des thymocytes travers microenvironnements orgue durant la maturation des lymphocytes reste mal définie.
La plupart ex vivo études réalisées à ce jour incluent foetales ou regroupement d’organe thymique cultures14,15, tranches de tissu ou des explants de lobe thymique intacte où les mouvements de thymocytes sont visualisées par deux photons laser à balayage microscopie (TPLSM)8, une technique d’imagerie intravitale restreint maximum distance de travail et d’imagerie profondeur de 1 mm selon le tissu examiné16. Par contraste avec les cultures d’organe thymique laborieux qui dépendent du temps d’incubation prolongée pour former des structures 3D-, fois, la technique de la tranche du thymus et l’introduction de permis contrôlé approche lobe thymique intact des sous-ensembles spécifiques du pré étiquetés thymocytes dans un environnement d’architecture native de tissu. Toutefois, étant donné que le débit sanguin est absent dans ces modèles, ils sont clairement limitées pour l’étude du processus de recrutement du thymus décantation progéniteurs (FST), le parenchyme du thymus ou la dynamique de l’égression thymique des lymphocytes T matures.
In vivo modèles pour l’étude de la physiologie de la maturation lymphocytes thymique chez les souris comprennent les greffons de fragments ou lobes organe entier placés soit à l’intérieur de la capsule rénale17 ou par voie intradermique18. Bien que ces options ont montré leur utilité pour interroger systémique fonctionnelle greffe des tissus, la position des greffes thymiques profonds au sein de l’animal ou recouverts par des couches de tissu opaque limite leur utilisation pour l’examen in vivo des implants par TPLSM.
La chambre antérieure de le œil offre un espace facilement accessible pour un contrôle direct de n’importe quel tissu greffé en vertu de la transparence des couches de la cornée. D’avantage, la base de la cavité formée par l’iris est riche en vaisseaux sanguins et les terminaisons nerveuses autonomes, permettant une revascularisation rapide et la réinnervation des greffes19,20. Dr. Caicedo a utilisé avec succès cet espace anatomique pour l’entretien et l’étude longitudinale des îlots pancréatiques dans le passé21. Ici, nous montrons que cette stratégie constitue non seulement une approche valable pour étudier la dynamique des thymocytes au sein de la structure native orgue, mais également unique permet d’étendre l’ in vivo des enregistrements longitudinales à l’étude du recrutement de l’ancêtre et égression de lymphocytes T mature étapes chez la souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
En raison de l’importance du processus de maturation des lymphocytes pour chaque compétence immunitaire4 et de l’impact présumé de dynamique cellule précurseur sur les T-cellules matures produites par le thymus2,3, des efforts considérables ont été investis pour développer des solutions de rechange à l’approche ponctuelle classique tissu fixe.
Bien que les tranches de tissus et autres explants son…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) et R21ES025673 (AC) et par l’octroi de meilleurs/2015/043 (Consellería de Educació, cultura j’ai esport, Generalitat valenciana, Valencia, Espagne) (EO). Auteurs tiennent à remercier l’équipe envoyés à l’Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valence, en Espagne et Alberto Hernandez au Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valence, Espagne, pour leur aide avec vidéo de tournage et de montage.
Materials
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
References
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?. Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
