No Vivo controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real
Summary
O objetivo do protocolo é mostrar longitudinal intravital acompanhamento em tempo real de timócitos por laser, microscopia em implantes do timo na câmara anterior do olho do rato. A transparência da córnea e vascularização do enxerto permitem gravar continuamente recrutamento de células progenitoras e egresso de células T maduro.
Abstract
O objetivo do método a ser apresentado é para mostrar, pela primeira vez, o transplante de recém-nascido thymi na câmara anterior do olho do isogénicas ratos adultos na vivo longitudinal monitoramento em tempo real da dinâmica de thymocytes´ dentro de um vascularizado segmento de timo. Após o transplante, laser, microscopia (LSM) através da córnea permite na vivo não invasiva imagens repetidas no nível celular resolução. Importante, a adiciona a maturação de células T intravital anterior modelos de imagem a possibilidade de recrutamento de células progenitoras contínua e gravações de egresso de células T maduras no mesmo animal. Vantagens adicionais do sistema são a transparência da área enxertada, permitindo monitoramento rápido macroscópico do tecido implantado, e a acessibilidade ao implante permitindo localizadas além de tratamentos sistémicos. A principal limitação, sendo o volume do tecido que se encaixa no espaço reduzido da câmara do olho que exige para o aparamento de lobo. Integridade do órgão é maximizada dissecando lobos do timo em padrões mostrados anteriormente para ser funcional para a produção de células T madura. A técnica é potencialmente adequada para interrogar um meio de clinicamente relevantes questões relacionadas com a função do Timo que incluem auto-imunidade, imunodeficiência e tolerância central; processos que permanecem mecanicamente mal definidos. A dissecação bem dos mecanismos orientadores timócitos migração, diferenciação e seleção deve levar a novas estratégias terapêuticas, visando o desenvolvimento de células T.
Introduction
Diferenciação de células T intratímica e seleção de subpopulação de células T constituem processos-chave para o desenvolvimento e a manutenção da imunidade mediada por células de vertebrados1. Esse processo envolve uma sequência complexa de eventos firmemente organizados, incluindo o recrutamento de progenitores da corrente sanguínea, migração e proliferação celular, expressão diferencial de proteínas de membrana e morte celular programada maciça para subconjuntos seleção. O resultado é a liberação de T-células maduras reativas para um amplo espectro de antígenos estranhos ao exibir respostas minimizadas para autopeptídeos, que acabar-se colonizar os órgãos linfoides secundários do individual2,3. Seleção de timócitos aberrante do repertório αβTCR leva à doença auto-imune ou desequilíbrio imune4 que derivam principalmente de defeitos durante os processos de seleção de precursor negativo ou positivo, respectivamente.
Migração direcional de timócitos através do timo é intrínseca a todas as fases de maturação de células T e é previsto como uma série de simultânea ou sequencial a vários estímulos, incluindo quimiocinas, adesivas, e adesivo de matriz extracelular (ECM) 3,de interações proteína5. O estudo dos tecidos fixos tornou a informação crítica sobre os padrões de expressão de pistas migratórias de timócitos no microambiente tímico definidos5,6, enquanto estudos ex vivo revelou dois prevalente comportamentos migratórios de timócitos em duas áreas histologicamente distintas do órgão: lento movimentos estocásticos no córtex e motilidade rápida, confinada na medula7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. aumento taxas migratórias correlacionam com selecção positiva do Timo13 e seleção negativa é associada com o comportamento de rastreamento apoiam a hipótese de que a cinética da viagem através do Timo determina o próprio maturação dos timócitos. Apesar de sua relevância, a topologia de interações de células estromais de timócitos e a dinâmica da motilidade de timócitos em microambiente do órgão durante a maturação de células T continua mal definida.
A maioria dos ex vivo estudos realizados até à data incluem fetais ou reaggregate órgão tímico culturas14,15, fatias de tecido ou explantes lóbulo tímico intacta, onde os movimentos de timócitos são visualizados por varredura a laser de dois fotões microscopia (TPLSM)8, uma técnica de imagem intravital com um máximo restrito trabalhando a distância e profundidade de 1 mm de acordo com o tecido de imagem examinou16. Em contraste com as culturas de laborioso órgão do Timo que dependem de tempos de incubação prolongado para formar estruturas de 3D, ambos, a técnica de fatia do Timo e a introdução de autorização controlada de abordagem lóbulo tímico intacta de subconjuntos específicos de pre-rotulado timócitos em um ambiente de arquitetura do tecido nativo. No entanto, desde que o fluxo sanguíneo é ausente nestes modelos, eles são claramente limitados para estudar o processo de recrutamento de Timo resolução progenitores (TSPs) para o parênquima do timo ou a dinâmica de egression do timo de células T maduras.
Modelos in vivo para o estudo da fisiologia de maturação de células T do timo em ratos incluem os enxertos de fragmentos ou lóbulos de todo órgão colocados tanto no interior do rim cápsula17 ou18por via intradérmica. Embora essas opções mostraram sua utilidade para interrogar a enxertia funcional sistêmica do tecido, a posição dos enxertos tímicos profundamente dentro do animal ou cobertos por camadas de tecido opaco restringe seu uso para exame na vivo de implantes pela TPLSM.
Câmara anterior do olho fornece um espaço facilmente acessível para monitoramento direto de qualquer tecido enxertado em virtude da transparência das camadas da córnea. De vantagem, a base da câmara formada pela íris é rica em vasos sanguíneos e terminações nervosas autonômicas, permitindo rápida revascularização e reinervação dos enxertos19,20. Dr. Caicedo tem utilizado com sucesso este espaço anatômico para a manutenção e o estudo longitudinal de ilhotas pancreáticas nos últimos21. Aqui, nós mostramos que esta estratégia não só constitui uma abordagem válida para estudar a dinâmica dos timócitos dentro da estrutura do órgão nativo, mas também excepcionalmente permite estender o na vivo gravações longitudinais para o estudo do recrutamento de progenitor e egression de células T madura passos em mouse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devido a importância do processo de maturação de células T de competência imunológica individual4 e o presumível impacto da dinâmica de célula precursora na T-células maduras, produzidas pela Timo2,3, grandes esforços foram investidos desenvolver alternativas para a abordagem de instantâneo clássico tecido fixo.
Apesar de fatias de tecido e outros explantes são claramente superiores em reproduzir a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações de NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) e R21ES025673 (AC) e pela concessão melhor/2015/043 (Consellería de Educació, cultura eu esport, Generalitat valenciana, Valência, Espanha) (EO). Autores agradecer a equipe enviada na Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valência, Espanha e Alberto Hernandez no Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valência, Espanha, por sua ajuda com filmagem e edição de vídeo.
Materials
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
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