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면역학 및 감염병학

(Hu-NSG) ratón humanizado del NOD/SCID/IL2rγnull modelo para estudios de latencia y replicación del VIH

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58255
, , , ,
1Department of Molecular and Cellular Biology,Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences,Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

Este protocolo proporciona un método para crear ratones humanizados (hu-NSG) vía intrahepática inyección de células madre hematopoyéticas humanas en ratones NSG neonatales radiación-condicionada. El ratón hu-NSG es susceptible a la infección por VIH y la terapia combinatoria antirretroviral (carro) y sirve como un modelo fisiopatológico adecuado para investigaciones de replicación y latencia del VIH.

Abstract

Normas éticas y desafíos técnicos para la investigación en patología humana, Inmunología y desarrollo terapéutico han colocado pequeños modelos animales en alta demanda. Con un genético y de comportamiento parecido a los seres humanos, pequeños animales como el ratón son buenos candidatos para los modelos de enfermedades humanas, a través del cual se recapitulan respuestas y humano-como síntomas. Además, el fondo genético del ratón puede modificarse para dar cabida a diversas demandas. El ratónnulo (NSG) NOD/SCID/IL2rγ es una de las cepas más ampliamente utilizado de ratón inmunocomprometidos; permite engraftment de células madre hematopoyéticas humanas o tejidos humanos y el desarrollo subsecuente de un sistema inmune humano funcional. Este es un hito fundamental en la comprensión del pronóstico y la fisiopatología de enfermedades humanos específicos como el VIH/SIDA y ayudar a la búsqueda de una cura. Adjunto, Divulgamos un protocolo detallado para generar un modelo de ratón humanizado de NSG (hu-NSG) por trasplante de células madre hematopoyéticas en un ratón NSG neonatal radiación-condicionada. El modelo de ratón de hu-NSG muestra desarrollo multilineal de trasplantado células madre humanas y susceptibilidad a la infección viral por VIH-1. También recoge características biológicas en respuesta a la terapia combinatoria antirretroviral (carro).

Introduction

Porque el establecimiento de adecuados modelos animales para enfermedades humanas, es clave para encontrar una cura, modelos animales apropiados durante mucho tiempo han sido perseguidos y mejorado con el tiempo. Se han desarrollado múltiples variedades de modelos murinos immunocompromised que permitan el engraftment de células humanas o de los tejidos y la posterior ejecución de funciones humanizado1,2. Estos modelos de ratón humanizado son críticos para la investigación de enfermedades específicas de humanos3,4,5.

Síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) resultando de la infección con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) es un ejemplo. Antes del establecimiento de modelos de ratón humanizado, limitaciones éticas y técnicas limitan estudios animales preclínicos de VIH/SIDA a primates no humanos3. Sin embargo, los altos gastos y requisitos para la atención especializada para tal animal dificultan estudios de VIH/SIDA en entornos académicos típicos. VIH principalmente infecta células humanas CD4 + T y afecta el desarrollo y la respuesta inmune de otras células humanas como células B, macrófagos y células dendríticas6; por lo tanto, pequeños modelos animales trasplantados con un sistema inmunológico humano funcional están en alta demanda.

Un avance se produjo en 1988, cuando CB17 –scid ratones con una mutación de Prkdcscid se desarrolló y demostró engraftment acertado del sistema inmunológico humano1. Los resultados de la mutación de Prkdcscid en funciones de las células T y B defectuosa y un sistema inmune adaptante seccionado en ratones, permitiendo el engraftment de humanos periféricos de la sangre las células mononucleares (PBMCs), las células madre hematopoyéticas (HSCs), y los tejidos hematopoyéticos fetales7,8. Sin embargo, niveles bajos del engraftment se observan con frecuencia en este modelo; las causas posibles son 1) residual actividad inmunológica innata modulada por natural killer (NK)-células y 2) el desarrollo de la etapa tardía de ratón (filtración) células T y B5. El desarrollo posterior de los diabéticos no obesos (cabeceo)-modelo de ratónscid logra dramático abajo-regulación de la actividad de células NK; así, es capaz de soportar un nivel más elevado y más sostenible engraftment del sistema inmunológico humano componentes9. Más suprimir o impedir el desarrollo de la inmunidad innata, modelos de ratón teniendo el truncamiento o el agujero ciego total de interleukin-2 receptor γ-cadena (Il2rg) en el (NOD) – Fondo descid fueron establecidos. Il2rg, también conocido como receptor del cytokine γ-cadena, es un componente indispensable de varios receptores de cytokine10,11,de12,13. Cepas como GUIÑO. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) y NODShi.Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) presentan robusta interrupción de ratón señalización de citoquinas y la ablación completa de desarrollo de la NK-célula, en Además de deterioro severo de la inmunidad adaptativa14,15,16.

Tres modelos de ratón humanizado teniendo un scid mutación y Il2rg nocaut con frecuencia se emplean en la investigación del VIH/SIDA: el modelo BLT (médula ósea/hígado/timo), el modelo de ABP (leucocitos de sangre periférica) y el modelo de la fuente (SCID repoblación celular) 3. BLT el modelo se crea vía quirúrgico trasplante de hígado fetal humano y timo bajo la cápsula del riñón de ratón acompañada con la inyección intravenosa del hígado fetal HSCs3,17,18. El modelo de ratón de BLT ofrece eficacia alta engraftment, desarrollo de las células hematopoyéticas humanas en todos los linajes y el establecimiento de un fuerte sistema inmune humano; Además, las células T son educadas en un timo humano autólogo y exhiben respuestas inmunitarias restricción HLA4,5,17,19. Sin embargo, la necesidad de procedimientos quirúrgicos sigue siendo el mayor inconveniente del modelo BLT. El modelo de ratón PBL se establece por la inyección intravenosa con linfocitos periféricos humanos. El modelo ABP ofrece comodidad y rendimientos engraftment acertado de la célula de T, pero su aplicación es limitada debido a la insuficiente de la célula de B y engraftment de células mieloides, engraftment bajo niveles general y el inicio de la severa injerto – versus – host disease (GVHD)3 ,20. El modelo de ratón de fuente se establece mediante inyección de HSCs humanas en ratones SCID de adultos jóvenes o recién nacidos. Exhibe el engraftment promedio eficiencia por encima del 25% (evaluado como sangre periférica CD45 porcentaje) y apoya el desarrollo de múltiple-linaje de HSCs inyectados y la elaboración de un sistema inmune humano innato. Sin embargo, la limitación del modelo de fuente es que la respuesta de células T es ratón H2-restringido en lugar de humanos HLA restringida14,21.

El modelo de ratón de la fuente se considera un modelo fácil y confiable para el VIH/SIDA pequeño animal estudios preclínicos, ejemplificado por el engraftment consistente de un sistema inmunológico humano y acertado desarrollo hematopoyético. Previamente informó de la creación de un modelo de ratón de NSG Hu-fuente-SCID (hu-NSG) y se describe su aplicación en la replicación del VIH y latencia estudios22,23,24. Este modelo de ratón de hu-NSG exhibe altos niveles de la médula ósea autoguiado hacia el blanco, susceptibilidad a la infección por el VIH y recapitulación de la infección por VIH y la patogénesis. Además, el modelo de ratón de hu-GSN responde adecuadamente a la terapia combinatoria antirretroviral (carro) y recapitula rebote viral del plasma sobre el retiro del carro, confirmando el establecimiento de un VIH latencia depósito25,26 ,27. Este embalse de latencia del VIH es más justificada por la producción de virus VIH réplica-competente ex vivo inducida por humanos CD4 + células T aisladas de ratones infectados y tratados con carro hu-NSG de descanso.

Adjunto, describimos el protocolo detallado para el establecimiento del modelo de ratón de hu-NSG de ratones neonatales de NSG, incluyendo procedimientos relacionados con el tratamiento del VIH infección y carro para el desarrollo de la latencia. Esperamos que este protocolo para ofrecer un nuevo conjunto de enfoques en los estudios animales sobre Virología VIH, latencia y tratamiento VIH.

Protocol

Todos los procedimientos y cuidado de los animales se han realizado según protocolos revisado y aprobado por la ciudad de esperanza Animal atención institucional y Comité de uso (IACUC) llevó a cabo por el investigador principal de este estudio (Dr. John Rossi, IACUC #12034). Tejido hepático fetal humano se obtuvo de recursos avanzados de biociencias (Alameda, CA), una organización sin fines de lucro, conforme a las regulaciones federales y estatales. El vendedor tiene su propia Junta de revisión institucional (IR…

Representative Results

Análisis de citometría de flujo se realiza con frecuencia para validar la pureza de HSCs aisladas, evaluar niveles de engraftment, perfil respuestas inmunes a la infección viral y encuesta sobre eficacia del carro. Un panel de anticuerpos típica contiene anticuerpos fluorescente etiquetados cada 4-6; así, un citómetro de flujo con láser múltiples y una amplia selección de filtros es fundamental para lograr resultados precisos. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-p…

Discussion

Immunocompromised ratones engrafted con células y tejidos humanos presentan características fisiológicas humanas y son un enorme valor para los estudios de patología, Fisiopatología e Inmunología sobre enfermedades específicas de humanos. Entre las múltiples cepas de ratones immunocompromised, el visto bueno. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) el modelo es el más inmunodeficientes debido a su falta de inmunidad innata y adaptativa, así como del cytokine de ratón específicos seccion…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud [otorgar números R01AI29329, R01AI42552 y R01HL07470 a J.J.R.] y el Instituto Nacional del cáncer de los institutos nacionales de salud [número de licencia P30CA033572 para la ciudad de esperanza genómica Integrativa Farmacología analítica y núcleos de citometría analítica]. El siguiente reactivo se obtuvo a través de los NIH NIH SIDA programa de investigación y referencia reactivo, División de SIDA del NIAID,: virus VIH BaL.

Materials

CD34 MicroBead Kit, human MiltenyiBiotec 130-046-703
CryoStor CS2 Stemcell Technologies 07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory 005557 Order breeders instead of experimental mice
IsoFlo Patterson Veterinary 07-806-3204 Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectant Fisher Sicentific NC9189926
Wescodyne Fisher Sicentific 19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needle Hamilton 80508 Custom made
Blood collection tube (K2EDTA) BD Bioscience 367843
Blood collection tube (Heparin) BD Bioscience 365965
Capillary tube (Heparinized) Fisher Sicentific 22-362574
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma Aldrich 11814389001
QIAamp Viral RNA mini kit Qiagen 52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix Thermofisher 4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) PerkinElmer NEK050B001KT
IgG from human serum Sigma Aldrich I4506-100MG
IgG from mouse serum Sigma Aldrich I5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) BD Biosciences 564586 RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) BD Biosciences 557851 RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) BD Biosciences 558116 RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) BD Biosciences 563795 RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) ThermoFisher MHCD1427 RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) ThermoFisher MHCD1904 RRID: AB_10373382, LOT 1725304B
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References

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Keywords: Hu-NSG Mouse ModelHIV ReplicationHIV LatencyNon-invasiveHuman Stem CellsCD34+ HSCsNOD/SCID/IL2rγnull MiceCARTHIV InfectionEngraftment ValidationFlow Cytometry
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Xia, X., Li, H., Satheesan, S., Zhou, J., Rossi, J. J. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J. Vis. Exp. (143), e58255, doi:10.3791/58255 (2019).
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