Humanizado NOD/SCID/IL2rγnula (hu-NSG) Mouse modelo para estudos de latência e a replicação do HIV
Summary
Este protocolo fornece um método para estabelecer ratos humanizados (hu-NSG) através da injeção de colestase de células estaminais hematopoiéticas em camundongos NSG neonatais condicionada por radiação. O mouse hu-NSG é suscetível à infecção pelo HIV e terapia anti-retroviral combinatória (carrinho) e serve como um modelo fisiopatológico apropriado para investigações de latência e a replicação do HIV.
Abstract
Normas éticas e desafios técnicos para a pesquisa em patologia humana, imunologia e desenvolvimento terapêutico colocaram modelos animais pequenos em alta demanda. Com uma estreita semelhança genética e comportamental aos seres humanos, animais pequenos, tais como o rato são bons candidatos para modelos de doenças humanas, através do qual podem ser instauradas respostas e sintomas parecidos com os humanos. Além disso, o fundo genético de rato pode ser alterado para acomodar demandas diversas. O NOD/SCID/IL2rγnula (NSG) é uma das variedades mais amplamente utilizado de rato imunocomprometidos; permite enxertia com células-tronco hematopoiéticas humanas e/ou tecidos humanos e o desenvolvimento posterior do sistema imunológico humano funcional. Este é um marco fundamental na compreensão do prognóstico e fisiopatologia das doenças de humanos específicos tais como HIV/AIDS e auxiliando a busca de uma cura. Neste documento, nós relatamos um protocolo detalhado para a geração de um modelo de mouse NSG humanizado (hu-NSG) pelo transplante de células-tronco hematopoiéticas para um rato NSG neonatal condicionada por radiação. O modelo do rato do hu-NSG mostra desenvolvimento multi linhagem de células-tronco humanas transplantadas e susceptibilidade à infecção viral do HIV-1. Ele também recapitula a principais características biológicas, em resposta à terapia anti-retroviral combinatória (carrinho).
Introduction
Porque estabelecer modelos animais apropriados para doenças humanas é a chave para encontrar uma cura, modelos animais apropriados tempo foram perseguidos e melhorados ao longo do tempo. Foram desenvolvidas múltiplas variedades de imunocomprometidos murino modelos que permitem a enxertia de células humanas e/ou tecidos e a subsequente execução de funções humanizada1,2. Tais modelos de rato humanizado são críticos para investigações de doenças de humanos específicos3,4,5.
Adquirida síndrome da imunodeficiência (AIDS) resultantes de infecção com o vírus de imunodeficiência humana (HIV) é um exemplo. Antes da criação de modelos de rato humanizado, limitações éticas e técnicas limita-se a estudos animais pré-clínicos de HIV/AIDS para primatas não-humanos3. No entanto, as despesas elevadas e requisitos para tratamento especializado para tal animal dificultam estudos de HIV/AIDS em configurações acadêmicos típicos. HIV, principalmente, infecta células humanas CD4 + T e impacto sobre o desenvolvimento e respostas imunes de outras células imunes humanas tais como as células B, macrófagos e células dendríticas6; Portanto, pequenos modelos animais transplantados com sistema de imunológico humano funcional estão em alta demanda.
Um grande avanço veio em 1988, quando os ratos CB17 –scid com uma mutação Prkdcscid foram desenvolvidos e mostrou a enxertia bem sucedida do sistema imunológico humano1. Os resultados de mutação Prkdcscid em funções de células T e B defeituosa e um ablated sistema imune adaptativo em camundongos, possibilitando a enxertia de periférico humano sangue células mononucleares (PBMC), células-tronco hematopoiéticas (linfócitos), e os tecidos hematopoiéticos fetais7,8. No entanto, níveis baixos de enxertia frequentemente são observados neste modelo; causas possíveis são 1) residual atividade imune inata modulada através de assassinas naturais (NK)-células e 2) o desenvolvimento de estágio final de rato – e B-células T (leakiness)5. O desenvolvimento posterior do diabético não-obesos (ASSENTIMENTO)-modelo de ratoscid alcançado dramática para baixo-regulação da atividade de células NK; assim, é capaz de suportar um nível mais alto e mais sustentável enxertia de de componentes do sistema imunológico humano9. Ainda mais inibem ou impedem o desenvolvimento da imunidade inata, modelos de rato tendo truncamento ou nocaute total da interleucina-2 receptor γ-cadeia (Il2rg) no (ASSENTIMENTO) – fundoscid foram estabelecidas. Il2rg, também conhecido como comum do cytokine receptor γ-cadeia, é um componente indispensável de várias citocinas receptores10,11,12,13. Cepas como NOD. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) e NODShi.Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) apresentam interrupção robusta de rato citocinas sinalização e ablação completa do desenvolvimento de células NK, em Além de grave comprometimento da imunidade adaptativa14,15,16.
Três modelos de rato humanizado, tendo um scid , mutação e nocaute Il2rg são frequentemente empregados na pesquisa de HIV/AIDS: o modelo BLT (medula óssea/fígado/Timo), o modelo PBL (leucócitos de sangue periférico) e o modelo SRC (SCID repovoamento celular) 3. o BLT modelo é criado através de cirurgia transplante de fígado fetal humano e Timo sob a cápsula do rim de rato acompanhado com injeção intravenosa de linfócitos feto fígado3,17,18. O modelo do rato de BLT oferece eficácia de enxertia alta, desenvolvimento de células hematopoiéticas humanas em todas as linhagens e o estabelecimento de um forte sistema imunológico humano; Além disso, as células T são educadas em um timo humano autólogo e prova HLA-restrito imune respostas4,5,17,19. No entanto, a exigência de procedimentos cirúrgicos continua a ser a grande desvantagem do modelo BLT. O modelo do rato do PBL é estabelecido pela injeção intravenosa com células linfoides periféricas humanas. O modelo PBL oferece conveniência e rende bem sucedida enxertia de células T, mas sua aplicação é limitada devido à insuficiente da B-pilha e enxertia de células mieloides, níveis baixos de enxertia globais e o aparecimento de grave enxerto doença contra o hospedeiro (GVHD)3 ,20. O modelo do rato do SRC é estabelecido através de injeção de linfócitos humanos em ratos adultos jovens ou recém-nascidos do SCID. Ele exibe a eficiência da enxertia média acima de 25% (avaliada como sangue periférico CD45 porcentagem) e suporta o desenvolvimento de múltiplos-linhagem de linfócitos injetados e a elaboração de um sistema imune humano inato. No entanto, a limitação do modelo SRC é que a resposta de células T é mouse H2-restrito em vez de humano HLA-restrito14,21.
O modelo do rato do SRC é considerado um modelo fácil e confiável para HIV/AIDS pequenos animais estudos pré-clínicos, exemplificado pela enxertia consistente de um sistema imunológico humano e desenvolvimento bem sucedido hematopoiético. Nós anteriormente relatado o estabelecimento de um modelo de mouse NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) e descreveu a sua aplicação na replicação do HIV e latência estudos22,23,24. Este modelo de rato hu-NSG apresenta níveis elevados de hospedagens de medula óssea, susceptibilidade à infecção pelo HIV e recapitulação da infecção pelo HIV e patogênese. Além disso, o modelo do rato do hu-NSG responde adequadamente à terapia antiretroviral combinatória (carrinho) e recapitula rebote viral do plasma após retirada do carrinho, confirmando o estabelecimento de um HIV latência reservatório25,26 ,,27. Este reservatório de latência do HIV é secundado pela produção da replicação vírus HIV ex vivo induzida por humanos células CD4 + T-isoladas de ratos infectados e tratados com carrinho hu-NSG a descansar.
Aqui, descrevemos o protocolo detalhado para a criação do modelo do mouse hu-NSG de ratos NSG neonatais, incluindo os procedimentos relacionados ao tratamento de infecção e carrinho de HIV para desenvolvimento de latência. Esperamos que este protocolo para oferecer um novo conjunto de abordagens em estudos com animais HIV sobre virologia de HIV, latência e tratamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ratos imunodeprimidos incorporados com células/tecidos humanos apresentam características fisiológicas de humanos e são um enorme valor para estudos de patologia, fisiopatologia e Imunologia sobre doenças específicas de humanos. Entre várias cepas de ratos imunodeprimidos, o assentimento. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) modelo é o mais imunodeficientes devido à sua falta de imunidade inata e adaptativa, bem como retirada do mouse específicas citocinas sinalização<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health [conceder números R01AI29329, R01AI42552 e R01HL07470 para J.J.R.] e Instituto Nacional de câncer do institutos nacionais da saúde [número de concessão P30CA033572 para apoiar a cidade de Hope Integrative Genomics Farmacologia analítica e núcleos de análise Cytometry]. O reagente a seguir foi obtido através de NIH AIDS Programa de pesquisa e referência reagente, divisão de AIDS, NIAID, NIH: vírus HIV BaL.
Materials
| CD34 MicroBead Kit, human | MiltenyiBiotec | 130-046-703 | |
| CryoStor CS2 | Stemcell Technologies | 07932 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji | The Jackson Laboratory | 005557 | Order breeders instead of experimental mice |
| IsoFlo | Patterson Veterinary | 07-806-3204 | Order through animal facility, restricted item |
| Clidox disinfectant | Fisher Sicentific | NC9189926 | |
| Wescodyne | Fisher Sicentific | 19-818-419 | |
| Hamilton 80508 syringe/needle | Hamilton | 80508 | Custom made |
| Blood collection tube (K2EDTA) | BD Bioscience | 367843 | |
| Blood collection tube (Heparin) | BD Bioscience | 365965 | |
| Capillary tube (Heparinized) | Fisher Sicentific | 22-362574 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma Aldrich | 11814389001 | |
| QIAamp Viral RNA mini kit | Qiagen | 52906 | |
| TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix | Thermofisher | 4444434 | |
| HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) | PerkinElmer | NEK050B001KT | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506-100MG | |
| IgG from mouse serum | Sigma Aldrich | I5381-10MG | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) | BD Biosciences | 564586 | RRID: AB_2732068, LOT 6347696 |
| PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) | BD Biosciences | 557851 | RRID: AB_396896, LOT 6021877 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) | BD Biosciences | 558116 | RRID: AB_397037, LOT 6224744 |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) | BD Biosciences | 563795 | RRID: AB_2722501, LOT 6210668 |
| APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) | ThermoFisher | MHCD1427 | RRID: AB_10373536, LOT 1684947A |
| PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) | ThermoFisher | MHCD1904 | RRID: AB_10373382, LOT 1725304B |
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