JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
면역학 및 감염병학

Humanized hilsen/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) mus modell for HIV replikering og ventetid studier

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58255
, , , ,
1Department of Molecular and Cellular Biology,Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences,Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

Denne protokollen gir en metode for å etablere humanized mus (hu-NSG) via intrahepatic injeksjon for menneskelige blodkreft stamceller i stråling-conditioned neonatal NSG mus. Hu-NSG musen er utsatt for HIV-smitte og kombinasjon antiretroviral terapi (handlevogn) og fungerer som en egnet patofysiologiske modell for HIV replikering og ventetid undersøkelser.

Abstract

Etiske regler og tekniske utfordringer for forskning i menneskelig patologi, immunologi og terapeutiske utvikling har plassert små dyr modeller i høy etterspørsel. Med en nær genetiske og atferdsmessige likhet med mennesker er små dyr som musen gode kandidater for menneskelig sykdom modeller som menneske-lignende symptomer og svar kan bli recapitulated. Videre kan musen genetisk bakgrunnen endres for å imøtekomme ulike krav. Hilsen/SCID/IL2rγnull . (NSG) musen er en av de mest brukte immunsupprimerte musen stammene; Det kan engraftment med menneskelige blodkreft stamceller og/eller menneskelig vev og senere utvikling av en funksjonell menneskets immunsystem. Dette er en viktig milepæl i forstå prognosen og patofysiologi av menneske-spesifikke sykdommer som HIV/AIDS og hjelpe søk etter en kur. Her, rapportere vi en detaljert protokoll for å generere en humanized NSG musemodell (hu-NSG) ved blodkreft stamcelletransplantasjon i stråling-conditioned neonatal NSG mus. Hu-NSG musemodell viser flere avstamning utvikling av transplantert menneskelige stamceller og mottakelighet for HIV-1 virusinfeksjon. Det viser også viktige biologiske egenskaper svar kombinasjon antiretroviral terapi (handlevogn).

Introduction

Etablere passende dyr modeller for menneskelig sykdommer er nøkkelen til å finne en kur, har lenge riktig dyr modeller blitt forfulgt og bedre over tid. Flere stammer av immunsupprimerte murine modeller har blitt utviklet som tillater engraftment av menneskelige celler og/eller vev og den påfølgende henrettelsen humanized funksjoner1,2. Slike humanized musen modeller er avgjørende for undersøkelser av menneske-spesifikke sykdommer3,4,5.

Ervervet uimottakelig mangel syndrom (AIDS) som følge av infeksjon med humant immunsviktvirus (HIV) er ett eksempel. Før etableringen av humanized musen modeller begrenset etiske og teknisk begrensninger HIV/AIDS prekliniske dyrestudier til ikke-menneskelige primater3. Men hindre den høye utgifter og krav for spesialisert omsorg for slike dyr HIV/AIDS studier i vanlige akademiske innstillinger. HIV primært infiserer menneskelige CD4 + T-celler og virkninger utvikling og immunreaksjoner av andre menneskelige immunceller som B-celler, makrofager og dendrittiske celler6; små dyr modeller transplantert med funksjonell menneskelige immunforsvar er derfor i høy etterspørsel.

Et gjennombrudd kom i 1988, da CB17 –scid mus med en Prkdcscid mutasjon var utviklet og viste vellykkede engraftment av menneskets immunsystem1. Prkdcscid mutasjon resultatene i defekt T – og B-celle funksjoner og en ablated adaptive immunsystemet i mus, og dermed gjør engraftment for menneskelig perifere blod mononukleære celler (PBMCs), blodkreft stamceller (HSCs), og fosterets blodkreft vev7,8. Likevel, lave nivåer av engraftment er ofte observert i denne modellen; mulige årsaker er 1) gjenværende medfødte immunforsvaret aktivitet modulert via naturlig killer (NK)-celler og 2) sent utviklingen av musen T – og B-celler (leakiness)5. Senere utvikling av den ikke-obese diabetiker (NIKKER)-scid musemodell oppnådd dramatiske ned-regulering av NK celler aktivitet. Dermed er det støtte et høyere nivå og mer bærekraftig engraftment menneskets immunsystem komponenter9. Å undertrykke eller hindre utvikling av medfødt immunitet, musen modeller med trunkering eller total knockout av interleukin-2 reseptor γ-kjeden (Il2rg) (NIKK) –scid bakgrunn ble etablert. Il2rg, også kjent som vanlig cytokin-reseptor γ-kjeden, er en uunnværlig del av ulike cytokin reseptorer10,11,12,13. Belastninger NIKK. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) og NODShi.Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) presentere robust avbrudd musen cytokin signalnettverk og komplett ablasjon av NK celler utvikling, i tillegg til alvorlig svekkelse av adaptiv immunitet14,15,16.

Tre humanized musen modeller bærer en scid mutasjon og Il2rg knockout er ofte ansatt i HIV/AIDS-forskning: BLT (benmarg/lever/Thymus) modell, PBL (perifert blod leukocytter) modellen og SRC (SCID Repopulating celle) modellen 3. the BLT modell er skapt via kirurgiske transplantasjon av menneskelig fosterets leveren og thymus under mus nyre kapselen sammen med intravenøs injeksjon fosterets lever HSCs3,17,18. BLT musemodell tilbyr høy engraftment effekt, utvikling av menneskelige blodkreft cellene i alle linjene, og etablering av en sterk menneskets immunsystem; i tillegg T-celler er utdannet en menneskelig autologous thymus og utstillingen HLA-begrenset immunreaksjoner4,5,17,19. Kravet om kirurgiske prosedyrer er imidlertid den store ulempen av BLT modellen. PBL musemodell er etablert av intravenøs injeksjon med perifere lymfoide menneskeceller. PBL modellen tilbyr bekvemmeligheten og gir vellykket T-celle engraftment, men programmet er begrenset på grunn av utilstrekkelig B-celle og myelogen celle engraftment, lav engraftment nivåer generelle og utbruddet av alvorlig graft – versus – host sykdom (GVHD)3 ,20. SRC musemodell opprettes via injeksjon av menneskelig HSCs i nyfødte eller unge voksne SCID mus. Den viser gjennomsnittlig engraftment effektivitet over 25% (innebærer perifert blod CD45 prosent) og støtter flere-lineage utviklingen av injisert HSCs og utdypning av en medfødte immunsystemet. Begrensning av SRC-modellen er imidlertid at den T-celle responsen er musen H2-begrenset i stedet for menneskelig HLA-begrenset14,21.

SRC musemodell anses lettvinte og pålitelig modell for prekliniske HIV/AIDS liten dyrestudier, eksemplifisert ved den konsekvent engraftment av menneskets immunsystem og vellykket blodkreft utvikling. Vi har tidligere rapportert etableringen av en NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) musemodell og beskrevet anvendelsen i HIV replikering og ventetid studier22,23,24. Denne hu-NSG musemodell har høye nivåer av benmarg homing, mottakelighet for HIV-smitte og recapitulation av HIV-smitte og patogenesen. I tillegg hu-NSG musemodell svarer riktig kombinasjon antiretroviral terapi (handlevogn) og viser plasma viral etterpå på handlevognen tilbaketrekking, bekrefter etableringen av en HIV ventetid reservoaret25,26 ,27. Dette HIV ventetid reservoar understrekes ytterligere av produksjonen av replikering kompetente HIV virus ex vivo indusert av menneskelig hviler CD4 + T-celler isolert fra infiserte og handlevogn-behandlet hu-NSG mus.

Her beskriver vi detaljerte protokollen for etablering av hu-NSG musemodell fra neonatal NSG mus, inkludert prosedyrer knyttet til HIV-infeksjon og kjerre behandling for ventetid utvikling. Vi forventer denne protokollen å tilby et nytt sett med tilnærminger i HIV dyrestudier om HIV virologi, ventetid og behandling.

Protocol

Alle dyr omsorg og prosedyrer er utført i henhold til protokoller vurdert og godkjent av byen av håp institusjonelle dyr omsorg og bruk Committee (IACUC) av rektor investigator av denne studien (Dr. John Rossi, IACUC #12034). Menneskelige fosterets leveren vev er Hentet fra avansert Bioscience ressurser (Alameda, CA), en ideell organisasjon, i henhold til føderale og statlige regler. Leverandøren har egne institusjonelle Review Board (IRB) og er kompatibel med subjektet beskyttelseskravene. Menneskelig PBMCs er isole…

Representative Results

Flyt cytometri analyse utføres ofte for å validere renheten av isolerte HSCs, evaluere engraftment nivåer, profil immunreaksjoner til viral infeksjon, og undersøkelser handlevogn effekt. En typisk antistoff-panelet inneholder 4-6 individuelle fluorescently merket antistoffer; Dermed er en flyt cytometer med flere lasere og et bredt utvalg av filtre avgjørende for å oppnå nøyaktige resultater. For første engraftment vali…

Discussion

Immunsupprimerte mus engrafted med menneskelige celler/vev presentere menneskelignende fysiologiske egenskaper og er en enorm verdi for patologi, pathophysiology og immunologi studier om human-spesifikke sykdommer. Blant flere stammer av immunsupprimerte mus, NIKK. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) er den mest immunodeficient på grunn av sin mangel på både medfødte og adaptive immunitet, samt ablated mus-spesifikke cytokin signalering3,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [gi nummer R01AI29329, R01AI42552 og R01HL07470 til J.J.R.] og National Cancer Institute av National Institutes of Health [bevilgning nummer P30CA033572 å støtte byen av håpe integrerende Genomics Analytiske farmakologi og analytisk cytometri kjerner]. Følgende reagensen var oppnådd gjennom NIH AIDS-forskning og referanse reagens Program, avdeling av AIDS, NIAID, NIH: HIV BaL virus.

Materials

CD34 MicroBead Kit, human MiltenyiBiotec 130-046-703
CryoStor CS2 Stemcell Technologies 07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory 005557 Order breeders instead of experimental mice
IsoFlo Patterson Veterinary 07-806-3204 Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectant Fisher Sicentific NC9189926
Wescodyne Fisher Sicentific 19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needle Hamilton 80508 Custom made
Blood collection tube (K2EDTA) BD Bioscience 367843
Blood collection tube (Heparin) BD Bioscience 365965
Capillary tube (Heparinized) Fisher Sicentific 22-362574
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma Aldrich 11814389001
QIAamp Viral RNA mini kit Qiagen 52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix Thermofisher 4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) PerkinElmer NEK050B001KT
IgG from human serum Sigma Aldrich I4506-100MG
IgG from mouse serum Sigma Aldrich I5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) BD Biosciences 564586 RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) BD Biosciences 557851 RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) BD Biosciences 558116 RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) BD Biosciences 563795 RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) ThermoFisher MHCD1427 RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) ThermoFisher MHCD1904 RRID: AB_10373382, LOT 1725304B
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
  2. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
  3. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
  4. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  5. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
  6. Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
  7. McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  8. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
  9. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  10. Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
  11. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  12. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  13. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  14. Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
  15. McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  16. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
  17. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
  18. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  19. Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
  20. King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
  21. Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
  22. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
  23. Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
  24. Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
  25. Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
  26. Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
  27. Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O’Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
  28. Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
  29. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
  30. Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -. P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
  31. van’t Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
  32. Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
  33. Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -. C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
  34. Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
  35. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  36. Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
  37. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  38. Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
  39. Chun, T. -. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  40. Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
  41. Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).

Tags

Hu-NSG Mouse ModelHIV ReplicationHIV LatencyNon-invasiveHuman Stem CellsCD34+ HSCsNOD/SCID/IL2rγnull MiceCARTHIV InfectionEngraftment ValidationFlow Cytometry
check_url/kr/58255?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xia, X., Li, H., Satheesan, S., Zhou, J., Rossi, J. J. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J. Vis. Exp. (143), e58255, doi:10.3791/58255 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image