基于基因组编辑的果蝇组织特异二进制转录系统的高效生成策略
Summary
在这里, 我们提出了一个方法, 以产生组织特定的二进制转录系统的果蝇, 取代第一编码外显子的基因与转录驱动。CRISPR/Cas9-based 方法在被替换的基因的内生调控下放置一个 transactivator 序列, 从而促进 transctivator 表达专门在基因特定的时空模式。
Abstract
二进制转录系统是强大的遗传工具, 广泛用于可视化和操作细胞的命运和基因表达在特定群体的细胞或组织的模型有机体。这些系统包含两个组分作为分开的转基因线。一条驱动线在组织特异的促进剂/促增强剂的控制下表达转录激活物, 一个报告/效应线将一个目标基因放置在转录激活器的结合部位。饲养两个组分的动物诱导了靶基因表达的组织特异转录激活。精确的时空表达基因在靶向组织是至关重要的无偏见的解释细胞/基因活动。因此, 开发一种生成专属细胞/组织特定驱动程序线的方法是必不可少的。在这里, 我们提出了一个方法来产生高度组织特定的目标表达系统, 采用 “聚集定期 Interspaced 短回文重复/CRISPR 相关” (CRISPR/Cas) 的基因组编辑技术。在这种方法中, 限制性 Cas9 的目标是两个嵌合导向 rna (gRNA) 到特定地点的第一编码外显子的基因在果蝇基因组, 以创建双链断裂 (争端)。随后, 使用含有 transactivator 序列的外源性捐赠质粒, 细胞自主修复机械能够实现争端处理机构的同源定向修复 (HDR), 从而精确删除和替换外显子与 transactivator序列。被敲入的 transactivator 是完全地表达在被替换的基因的cis调控元素起作用的细胞。在这里提出的详细的分步协议, 以产生一个二进制转录驱动程序表达在果蝇/branchless产生的上皮/神经细胞细胞可以采取任何基因或组织特定的表达。
Introduction
基因工具箱的目标基因表达已经在果蝇中得到了很好的发展, 这使得它成为一个最好的模型系统, 以调查有关基因的功能, 涉及多种细胞过程。二进制表达系统, 如酵母Gal4/UAS (上游活化序列), 首次采用的组织特异性增强诱捕和基因 misexpression 在果蝇遗传模型1 (图 1)。该系统促进了许多技术的发展, 如基因过度表达的时空调控, misexpression, 在选定的细胞组的挖空, 以及细胞消融, 细胞标记, 细胞和分子的实时追踪在发育过程中的胚胎和组织, 沿袭追踪和马赛克分析。一些二进制转录系统, 如细菌莱克萨/莱克萨操作系统 (图 1) 和粗糙Q 系统, 是强大的基因工具, 现在广泛用于果蝇,除了原 Gal4/UAS 系统的目标基因表达1,2,3。
在这里, 我们提出了一个方法来生成高可靠的组织特定的二进制表达系统, 采用基因组编辑技术。最近在 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术方面的进步, 使得在广泛的生物体中进行定向基因组改变的机会空前。与其他可用的基因组编辑技术相比, CRISPR/Cas9 系统成本低廉、效率高、可靠。这项技术利用细菌适应性免疫系统的组成部分:化脓链球菌的 Cas9 限制性, 创建双链断裂 (争端), 和嵌合体指南 RNA (gRNA), 它引导 Cas9 到一个特定的基因组站点目标争端4。这些细胞包含用不同途径修复争端的机器。非同源端连接 (NHEJ) 导致小的插入或删除, 以扰乱基因功能, 而同源定向修复 (hdr) 引入一个定义的定向/理想的基因组敲/敲出使用外源 HDR 捐赠者作为模板。基于 HDR 的替换策略可以有效地用于生成一个高度可靠的组织特定的二进制表达式系统, 它可以克服传统增强器陷阱方法的所有局限性。我们描述了一个循序渐进的过程, 利用 CRISPR/Cas9-based HDR 修复生成一个二进制转录驱动程序线的控制下表达的内源转录和转录后调节的果蝇基因。在本协议中, 我们演示了一个特定于branchless (bnl) 基因编码的驱动程序线的生成, 用于调节气管道上皮5的分支形态发生。在这个例子中, bnl基因的第一个编码外显子被细菌莱克萨transactivator 序列的序列所取代, 而不改变bnl基因的任何内源cis调节序列。我们表明, 该策略产生了一个bnl 莱克萨驱动程序线, spatiotemporally 控制在LexAoperator (LexAop或LexO) 下游的记者基因的表达, 完全在bnl-表达上皮细胞/间充质/神经细胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
传统上,果蝇增强器陷阱是由两种不同的方法产生的。其中一个方法包括随机插入一个驱动程序 (例如, Gal4) 序列在基因组中通过移位 (e., P 元素移位)1 。或者, 驱动程序序列可以放置在一个假定的增强/启动子区域的转录控制的质粒结构, 然后将集成到基因组3,11的异位点。虽然这些方法已经产生了大量的Gal4或<em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 f 港博士、奥康纳博士和冯博士就 CRISPR 战略进行讨论;肺结核科恩伯格博士和布卢明顿试剂中心;UMD 成像核心设施;和从 NIH 获得的资金: R00HL114867 和 R35GM124878 到 SR。
Materials
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Molecular Biology |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Molecular Biology |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Molecular Biology |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Molecular Biology |
| 10%SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Molecular Biology |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Molecular Biology |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Molecular Biology |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Molecular Biology |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Molecular Biology |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Molecular Biology |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Molecular Biology | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Molecular Biology |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Molecular Biology |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
References
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