Изменение бакуловирусы векторы выражения производить выделяется растительных белков в клетках насекомых
Summary
Здесь мы представляем протоколы для использования насекомых клеток и бакуловирусы системе выражения протеина для производства большого количества белков растений выделяется для кристаллизации белка. Вектор выражения бакуловирусы был изменен с GP67 или насекомое hemolin пептид сигнала для растений секрецию белков в клетках насекомых.
Abstract
Это был вызов для ученых выразить рекомбинантных белков секреторной эукариотических структурных и биохимических исследований. Система выражение бакуловирусы опосредованной насекомых клеток является одной из систем, используемых для Экспресс рекомбинантных белков эукариотических секреторной с некоторыми столб-поступательные изменения. Выделительные протеины должны направляться через выделительные пути гликозилирования белков, формирования дисульфидными облигаций и других столб-поступательные изменения. Для улучшения существующих насекомых клеток выражение секреторной растительных белков, вектор выражения бакуловирусы изменяется путем добавления либо GP67 или hemolin сигнал пептид последовательность между промоутер и клонирование несколько сайтов. Этот недавно разработанный изменение вектора системы успешно производит высокий урожай растворимых рекомбинантных выделяется завод рецептор белков Arabidopsis thaliana. Два из выраженных растительных белков, внеклеточных доменов Arabidopsis ДТР и PRK3 плазмы мембранных рецепторов, были обобщены кристаллографических рентгеновских исследований. Изменение вектора система является усовершенствованный инструмент, который потенциально может использоваться для выражения рекомбинантных белков секреторной в животном царстве также.
Introduction
Это необходимо для научно-исследовательская лаборатория быть способны производить большое количество однородных рекомбинантных белков на биохимические и биофизические характеристики, особенно для рентгеновских кристаллографических исследований. Существует много устоявшихся гетерологичных выражение систем, таких как кишечная палочка, дрожжи, насекомых клетки, клетки млекопитающих, клетки растений, и т.д. среди них, система выражение бакуловирусы опосредованной насекомых клеток является одним из самых часто используемых методов для получения большого количества структурно сложенном крупногабаритных рекомбинантных эукариотических белков для кристаллизации протеина1.
Векторы выражения бакуловирусы выражение системы разработаны для содержать сильное polyhedrin или P10 промоутер для получения высокой доходности рекомбинантных внутриклеточные белки2,3. Чтобы сделать рекомбинантных бакуловирусы, гена интереса клонируется в насекомых вектор, содержащий очагов генома multi-nucleopolyhedroviral californica Металловидка polyhedrin (polh). Результате конструкция затем упорядочивать и проверить его правильное чтение открытые рамки (ORF). Правильную конструкцию затем вводят в клетки-хозяина насекомых в процессе transfection. Гена интереса вставляется в вирусного генома гомологичная рекомбинация. Это событие приводит к производству рекомбинантных вирусного генома, который затем реплицирует производить рекомбинантные окулировкой вирусных частиц1.
Насекомое клетки, которые наиболее часто используются в системе выражения являются Sf9 и высокий пять (Hi5) клетки. Sf9 клетки являются клоновых изолировать Sf21, производные от куколки яичников клетки Spodoptera frugiperda, и Hi5 клетки клоновых изолировать, производные от родительского Trichoplusia ni яичников клеток линии TN-3684,5. Со transfections, вирус амплификации и налета анализы проводятся на Sf9 клетки, в то время как Hi5 клетки обычно выбираются производить большее количество рекомбинантных белков6. Стоит отметить, что клетки Hi5 не подходят для генерации и усиления потомков вируса из-за их тенденция производить мутантов вирусов. Традиционно в диапазоне температур 25-30 ° c считается хорошо для культивирования клеток насекомых. Однако сообщалось, что 27-28 ° C — оптимальная температура для насекомых клеток роста и инфекции7,8.
Введение сильный сигнал последовательности предыдущих ген необходима высокая экспрессия секретируемые белки. Последовательность сигнала будет эффективно руководство перевод рекомбинантных белков в эндоплазматический ретикулум секрецию белка и столб-поступательные изменения, необходимые для надлежащего складные и стабилизации3. Сигнальные последовательности пептид, такие как бакуловирусы конверт белков GP64/67, мелиттин медоносной пчелы и другие, были выбраны для облегчения выражение секреторной рекомбинантных белков в бакуловирусы опосредованной выражение систем3. Было показано, что введение сигнала пептидные GP67 улучшить доходность выражение секретируемые рекомбинантных белков, по сравнению с использованием встроенных сигнала пептид целевого гена9. Hemolin — гемолимфа белок гигантский мотылек шелка Hyalophora цекропии, индуцированных после бактерии инфекции10. Из-за относительно высокого уровня индуцированного выражения сигнал пептид последовательность гена может использоваться посредником секрецию выражение рекомбинантных белков в системе бакуловирусы насекомое клеток.
A. thaliana Tracheary элемент дифференциации тормозящий фактор рецептор (ДТР) и 3 киназы рецепторов пыльцы (PRK3), оба принадлежат к семейству растений лейцин богатые киназы рецепторов как повтор (LRR-RLK) белки11,12 . Для того, чтобы изучить структуру и функции этого семейства растений рецептор белков, а также облегчения структурных и биохимических характеристик других выделяется растительных белков, клеток бакуловирусы насекомое выражение системы была изменена для улучшение качества и производства урожайность белка. Внеклеточных доменов ДТР и PRK3 успешно были выражены с помощью двух векторов измененное выражение в системе выражение бакуловирусы насекомое клеток. Было выкристаллизовывано внеклеточных доменов ДТР и PRK3 белков. Эта статья сообщает выражение и очистки больших объемов рекомбинантных секретируемые растительных белков с двух модифицированных бакуловирусы векторы выражения путем включения GP67 либо hemolin последовательность сигнала между организатором и несколько клонирования сайтов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Учитывая разнообразие в размер и стабильность тысяч белков, присутствующих в биологических системах, это часто эмпирических исследований лаборатории решить какие гетерологичных выражение системы должен быть выбран для выражения определенного белка. Выражение системы E. coli част?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана новый факультет запуска средства от университета штата Северная Каролина сайта для Guozhou Xu.
Materials
| Incubator shaker | VWR | Model Excella E25 | 27 oC |
| Incubator | VWR | Model 2005 | 27 oC |
| Centrifuge | BECKMAN | Model J-6 | with a swing bucket rotor |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent | 600677-51 | For PCR amplification of DNA |
| Thermal Cycler | BIO-RAD | Model C1000 Touch | For PCR amplification of DNA |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Model I 24 | For growing baceria culture |
| Customer DNA synthesis | GENSCRIPT | ||
| BamHI (HF) | New England Biolabs | R3136S | Restriction Endonuclease |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | Restriction Endonuclease |
| NotI (HF) | New England Biolabs | R3189S | Restriction Endonuclease |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Restriction Endonuclease |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | DNA ligation |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | DNA purification from Agorase gel |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid DNA purification from bacteria culture |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 15510-019 | For DNA gel electropherosis |
| MAX Efficiency DH5α competen cell | Invitrogen | 18-258-012 | For transformation of DNA ligation mixture |
| Lennox L LB Broth | Research Product International Corp. | L24066-5000.0 | For making bacteria culture |
| Ampicillin sodium salt | Thermo Fisher Scientific | 11593-019 | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 15160-054 | Antibiotics |
| Tetracycline | Thermo Fisher Scientific | 64-75-5 | Antibiotics |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710-064 | Antibiotics |
| MAX Efficiency DH10Bac competent cells | Thermo Fisher Scientific | 10361-012 | For making bacmid DNA |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544-034 | For DNA transformation |
| CellFECTIN II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362-101 | Insect cell transfection reagent |
| Bac-to-Bac Expression System | Thermo Fisher Scientific | 10359-016 | Baculovirus-insect cells expression kit |
| Bluo-gal | Thermo Fisher Scientific | 15519-028 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 15529-019 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| pFastBac1 | Thermo Fisher Scientific | 10360014 | Baculorirus expression vector |
| Sf9 cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 monolayer cells |
| Hi5 cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | High Five insect cells |
| Grace’s insect medium, unsupplemented | Thermo Fisher Scientific | 11595030 | Sf9 cell transfection minimum medium |
| Grace’s insect medium, supplemented | Thermo Fisher Scientific | 11605102 | Sf9 monolayer cell culture complete medium |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher Scientific | 10902104 | Sf9 suspension cell culture medium without FBS |
| Express Five SFM | Thermo Fisher Scientific | 10486025 | Hi5 cell culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 ml (10,000 I.U./ml) |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | 100 ml |
| FBS Certified | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | 500 ml |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 08-772-1B | Flat-bottom |
| 150 mm plates | Thermo Fisher Scientific | 353025 | 100/case |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 500 tubes/bag |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1475-0511 | 25 tubes/bag |
| 50 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1500-1211 | 25 tubes/bag |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | NiNTA resin |
| pH-indicator strips | EMD Millipore Corporation | 1.09535.0001 | pH 0 – 14 |
References
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).
- Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system. Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).
- Possee, R. D., King, L. A. Baculovirus Transfer Vectors. Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).
- Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro. 13, 213-217 (1977).
- Hink, W. F. Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni. Nature. 226, 466-467 (1970).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cellular & Development Biology – Animal. 29A, 388-390 (1993).
- Wickham, T. J., Nemerow, G. R. Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system. Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).
- Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion. Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).
- Murphy, C. I., et al. Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides. Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).
- Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily. Science. 250, 1729-1732 (1990).
- Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions. PLoS One. 12, e0175317 (2017).
- Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors. Scientific Reports. 8, 2796 (2018).
- Khorana, H. G. Total synthesis of a gene. Science. 203, 614-625 (1979).
- Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles. Gene. 1, 81-92 (1976).
- Xu, W., Zhang, Y. Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative. Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Reddy, B. G., et al. Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC. Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).
- Harris, T. J., Emtage, J. S. Expression of heterologous genes in E. coli. Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).
- Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements. International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).
- Guo, Y., Yang, F., Tang, X. An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells. Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).
- Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. Protein secretion pathway in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).
- Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).
- Wormald, M. R., Dwek, R. A. Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability. Structure. 7, R155-R160 (1999).
- Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems. Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).
- Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa. Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).
- Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).
- Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells. Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).
- Dohi, K., et al. Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells. Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).
