Summary

Modellierung von Tuberkulose Mycobacterium Marinum infizierten Erwachsenen Zebrafisch

Published: October 08, 2018
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Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Modell menschlichen Tuberkulose in einem Erwachsenen Zebrafisch mit seiner natürlichen Erreger Mycobacterium Marinum. Extrahierte DNA und RNA aus den inneren Organen der infizierten Zebrafisch lässt sich zeigen, dass die Summe mykobakteriellen in die Fische und Immunantwort des Wirtes mit qPCR lädt.

Abstract

Mycobacterium Tuberculosis ist derzeit die tödlichsten menschlicher Erreger 1,7 Millionen Tote und 10,4 Millionen Infektionen jährlich. Belastung durch dieses Bakterium verursacht eine große Krankheit Spektrum beim Menschen von einer sterilisierten Infektion bis hin zu einer aktiv fortschreitenden tödlichen Krankheit. Die häufigste Form ist die latente Tuberkulose, die asymptomatisch, aber hat das Potential, in eine fulminante Krankheit zu reaktivieren. Erwachsenen Zebrafisch und seine natürliche Erreger Mycobacterium Marinum vor kurzem erwiesen sich ein anwendbaren Modell, das große Krankheit Spektrum der Tuberkulose zu studieren. Wichtig ist, können spontane Latenz sowie Reaktivierung und adaptive Immunantworten im Rahmen der mykobakteriellen Infektion in diesem Modell untersucht werden. In diesem Artikel beschreiben wir Methoden für die experimentelle Infektion von Erwachsenen Zebrafisch, der Sammlung der inneren Organe für die Extraktion von Nukleinsäuren für die Messung der mykobakteriellen Lasten und Host Immunantwort durch quantitative PCR. Die in-house entwickelten, M. Marinum –spezifische qPCR-Assay ist empfindlicher als die traditionellen Beschichtung-Methoden, da es auch DNA aus nicht teilt, ruhend oder kürzlich verstorbener Mykobakterien erkennt. Wie DNA und RNA aus der gleichen Person gewonnen werden, ist es möglich, die Beziehungen zwischen den krankhaften Zustand, und der Wirt und Erreger Genexpression zu studieren. Die Erwachsenen Zebrafisch-Modell für Tuberkulose präsentiert sich somit als sehr zutreffend, nicht-Säugetier in Vivo System zu Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen.

Introduction

Zebrafisch (Danio Rerio) ist eine weit verbreitete Tiermodell in der biomedizinischen Forschung, und es ist eine akzeptierte Modell für gemeinsame vertebrate Biologie. Der Zebrabärbling adaptiert wurde zu vielen Bereichen der Forschung Modellierung menschliche Krankheiten und Störungen, Krebs1 und Herzerkrankungen2 bis hin zu Infektionen und immunologische Studien aus mehreren bakteriellen 3 und Virusinfektionen4 , 5. Darüber hinaus die Entwicklung ex Utero Zebrafisch-Embryonen erzielt der Zebrabärbling ein beliebtes Modell in Entwicklungsbiologie6 und Toxikologie7,8.

In vielen Bereichen der Forschung, einschließlich der Infektionsbiologie sind die optisch transparenten zebrafischlarven gebräuchlich. Die ersten Immunzellen erscheinen innerhalb von 24 h Post Düngung (hpf), wenn primitive Makrophagen erkannten9sind. Neutrophile sind die nächsten Immunzellen rund 33 hpf10angezeigt werden. Zebrafisch-Larven sind somit für die Untersuchung der frühen Stadien der Infektion und die Rolle der angeborenen Immunität bei fehlender adaptive Immunzellen11möglich. Die Erwachsenen Zebrafisch mit seinem voll funktionsfähige adaptive Immunsystem bietet jedoch eine zusätzliche Schicht der Komplexität für Infektions-Experimente. T-Zellen können um durch erkannt werden 3 Tage nach Befruchtung12und B-Zellen sind in der Lage, funktionale Antikörper produzieren 4 Wochen Post Befruchtung13. Die Erwachsenen Zebrafisch hat die wichtigsten Gegenstücke des Säugetier-angeborenen und der adaptiven Immunsystems. Die wichtigsten Unterschiede zwischen den Immune systems von Fischen und Menschen werden in Antikörper-Klassen ebenso wie in der Anatomie des lymphatischen Geweben gefunden. Der Zebrabärbling hat nur drei Antikörper Klassen14, während Menschen fünf15haben. In Ermangelung von Knochenmark und Lymphknoten der primären lymphatischen Organe in den Fischen sind die Niere und die Thymus-16 und die Milz, die Nieren und den Darm als sekundären lymphatischen Organe17dienen. Trotz dieser Unterschiede, mit seiner vollen immun Arsenal der angeborenen und der adaptiven Zellen ist der Erwachsenen Zebrabärbling ein hoch anwendbar, einfach zu bedienende, nicht Mammalian Modell für Wirt-Pathogen-Wechselwirkungsstudien.

Der Zebrabärbling hat in letzter Zeit als eine praktikable Modell zur Tuberkulose18,19,20,21,22etabliert. Tuberkulose ist eine in der Luft Krankheit verursacht durch Mycobacterium Tuberculosis. Nach der World Health Organization Tuberkulose1,7 Millionen Todesopfer im Jahr 2016 und ist die führende Ursache des Todes von einem einzigen Erreger weltweit23. Mäuse24,25, Kaninchen26 und nicht-menschlichen Primaten27 sind die bekanntesten in der Tuberkuloseforschung aber jedes Gesicht ihre Grenzen Tiermodelle. Die nichtmenschlichen Primaten-Modell von M. Tuberkulose -Infektion ähnelt am ehesten der menschlichen Krankheit, aber mit Hilfe dieses Modells wird durch ernsthafte ethische Überlegungen. Anderen Tiermodellen sind durch die Wirtsspezifität von M. Tuberculosis behindert, die die Pathologie der Krankheit betrifft. Wahrscheinlich das größte Problem bei der Modellierung von Tuberkulose ist das breite Spektrum von Infektion und Krankheit folgen bei der menschlichen Krankheit: Tuberkulose ist eine sehr heterogene Erkrankung Immunität gegen latente, aktive und reaktivierten Infektion28 Sterilisation bis hin , das ist schwer zu reproduzieren und experimentell zu modellieren.

Mycobacterium Marinum ist ein enger Verwandter des M. Tuberculosis mit ~ 3.000 ortholog Proteine mit 85 % Aminosäure Identität29. M. Marinum infiziert natürlich Zebrafisch produziert Granulome, die Markenzeichen der Tuberkulose, in seiner inneren Organe19,30. Im Gegensatz zu anderen Tiermodellen in der Tuberkuloseforschung Zebrafisch produziert viele Nachkommen, es erfordert nur einen begrenzten Raum und wichtiger ist, es ist neurophysiologisch wenigsten entwickelten Wirbeltiere Tuberkulose-Modell zur Verfügung. Darüber hinaus verursacht die M. Marinum Infektion latente Infektion, aktiver Erkrankung oder auch Sterilisation von mykobakteriellen Infektion im Erwachsenen Zebrafisch eng imitiert das Spektrum der Krankheitsverläufe der menschlichen Tuberkulose19, 31 , 32. hier, wir beschreiben Methoden für das experimentelle Tuberkulose-Modell der Erwachsenen Zebrafisch durch M. Marinum in die Bauchhöhle injiziert und mittels quantitativen PCR zur Messung der mykobakteriellen Lasten und Immunreaktionen vom Zebrafisch Gewebeproben.

Protocol

Alle Zebrafisch-Experimente sind vom Tier Experiment Board in Finnland (ESAVI/8245/04.10.07/2015) genehmigt worden. Methoden sind nach dem Gesetz (497/2013) und der Regierungsverordnung (564/2013) zum Schutz der Versuchstiere zu wissenschaftlichen oder erzieherischen Zwecken in Finnland durchgeführt. 1. Anzucht von Mycobacterium Marinum Hinweis: Da Mycobacterium Marinum ein Erreger verursacht oberflächliche Infektionen beim Menschen fähig ist, erfahren Sie…

Representative Results

Die natürliche Fisch-Erregers Mycobacterium Marinum infiziert die inneren Organe der Zebrafisch und produziert eine systemische Infektion mit histologisch sichtbare Granulome19. Erwachsenen Zebrafisch durch eine intraperitoneale Injektion mit M. Marinum infiziert sind. DNA und RNA extrahiert und die mykobakteriellen Last bemisst sich quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) mithilfe von DNA als Vorlage. Die Gliederung der Methode ist in <str…

Discussion

Hier beschreiben wir eine qPCR-basierte Anwendung mykobakteriellen Lasten aus DNA extrahiert von experimentell infizierten Erwachsenen Zebrafisch Gewebe messen. Diese Anwendung basiert auf Primer entwickelt, um die 16-23 s rRNA internen übertragenen Distanzscheibe Sequenz40. Mykobakteriellen Gesamtlast in einer Fisch-Probe wird geschätzt mit Hilfe einer Standardkurve aus DNA extrahiert aus einer bekannten Anzahl von kultivierten Mykobakterien und vorausgesetzt, dass ein Bakterium hat eine Kopie …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die finnische kulturelle Stiftung (H.L.), Tampere Tuberculosis Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), Gründung des finnischen Anti-Tuberkulose-Vereins (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius Stiftung (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane und Aatos Erkko Stiftung (M.P.) und Academy of Finland (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo und Jenna Ilomäki sind für ihre technische Unterstützung anerkannt. Die Autoren erkennen die Tampere Zebrafisch-Labor für ihren Dienst.

Materials

Mycobacterium marinum American Type Culture Collection ATCC 927
Middlebrock 7H10 agar BD, Thermo Fisher Scientific 11799042
Middlebrock OADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Middlebrock 7H9 medium BD, Thermo Fisher Scientific 11753473
Middlebrock ADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
GENESYS20 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
Phenol red Sigma-Aldrich P3532
27G needle Henke Sass Wolf 4710004020
1 ml syringe Henke Sass Wolf 4010.200V0
Omnican 100 30G insulin needle Braun 9151133
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) Sigma-Aldrich A5040
1.5 ml homogenization tube Qiagen 13119-1000
2.8 mm ceramic beads Qiagen 13114-325
Ethanol, ETAX Aa Altia
2-propanol Sigma-Aldrich 278475
Chloroform VWR 22711.290
Guanidine thiocyanate Sigma-Aldrich G9277 FW 118.2 g/mol
Sodium citrate Sigma-Aldrich 1613859 FW 294.1 g/mol
Tris (free base) Sigma-Aldrich TRIS-RO FW 121.14 g/mol
TRI reagent Molecular Research Center TR118 Guanidine thiocyanate-phenol solution
PowerLyzer24 homogenizator Qiagen
Sonicator m08 Finnsonic
Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix Bioline BIO-98005
qPCR 96-well plate BioRad HSP9601
Optically transparent film BioRad MSB1001
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system BioRad
RNase AWAY Thermo Fisher Scientific 10666421 decontamination reagent eliminating RNases
DNase I Thermo Fisher Scientific EN0525
Reverse Transcription Master Mix Fluidigm 100-6298
SsoFast Eva Green master mix BioRad 172-5211

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Luukinen, H., Hammarén, M. M., Vanha-aho, L., Parikka, M. Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (140), e58299, doi:10.3791/58299 (2018).

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