Modellering tuberkulose i Mycobacterium marinum inficeret voksen zebrafisk
Summary
Vi præsenterer her, en protokol til model menneskelige tuberkulose i en voksen zebrafisk ved hjælp af dens naturlige patogen Mycobacterium marinum. Ekstraherede DNA og RNA fra de indre organer hos inficerede zebrafisk kan bruges til at afsløre alt mykobakterielle belastninger i fisk og værtens immunrespons med qPCR.
Abstract
Mycobacterium tuberkulose er i øjeblikket den dødeligste menneskelige patogen forårsager 1,7 millioner dødsfald og 10,4 millioner infektioner hvert år. Eksponering for denne bakterie forårsager en bred sygdom spektrum i mennesker lige fra en steriliseret infektion til et aktivt fremadskridende dødelig sygdom. Den mest almindelige form er den latent tuberkulose, som er asymptomatiske, men har potentiale til at genaktivere i et fulminant sygdom. Voksen zebrafisk og dens naturlige patogen Mycobacterium marinum har for nylig vist sig for at være en relevant model til at studere det brede sygdom spektrum af tuberkulose. Vigtigere, kan spontane ventetid samt reaktivering og adaptive immunrespons i forbindelse med mykobakterielle infektion studeres i denne model. I denne artikel vil beskrive vi metoder for eksperimentel infektion af voksen zebrafisk, indsamling af indre organer til udvinding af nukleinsyrer til måling af mykobakterielle belastninger og vært immunrespons ved kvantitativ PCR. Den i in-House udviklede, M. marinum –specifikke qPCR analyse er mere følsomme end de traditionelle plating metoder som det registrerer også DNA fra ikke-dividere, sovende eller for nylig døde mykobakterier. Som både DNA og RNA er udvundet fra den samme person, er det muligt at studere forholdet mellem den syge stat og vært og patogen genekspressionen. Voksen zebrafisk model for tuberkulose dermed præsenterer sig selv som en yderst relevant, ikke-pattedyr i vivo system at studere vært-patogen interaktioner.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) er et udbredt dyremodel i biomedicinsk forskning, og det er en accepteret model for fælles hvirveldyr biologi. For zebrafisk er blevet tilpasset til mange forskningsområder modellering menneskelige sygdomme og lidelser lige fra kræft1 og hjertesygdom2 til infektion og immunologiske undersøgelser af flere bakterielle 3 og virusinfektioner4 , 5. Derudover ex utero udviklingen af zebrafisk embryoner har gjort zebrafisk en populær model i udviklingsmæssige biologi6 og toksikologi7,8.
I mange områder af forskning, herunder infektion biologi, er optisk gennemsigtig zebrafisk larver almindeligt anvendt. De første immunceller vises inden for 24 timer post befrugtning (hpf), når primitive makrofager er opdaget9. Neutrofiler er de næste immunceller at dukke op omkring 33 hpf10. Zebrafisk larver er således muligt for at studere de tidlige stadier af infektion og rollen af medfødt immunitet i mangel af adaptive immunceller11. Men de voksne zebrafisk med sit fuldt funktionel adaptive immunsystem giver et ekstra lag af kompleksitet til infektion eksperimenter. T-celler kan påvises omkring 3 dage efter befrugtningen12, og B-celler er i stand til at producere funktionelle antistoffer ved 4 uger post befrugtning13. Den voksne zebrafisk har alle de vigtigste modstykker af de pattedyr medfødte og adaptive immunsystem. De væsentligste forskelle mellem immune systems af fisk og mennesker er fundet i antistof isotypes såvel som i anatomi af lymfoide væv. For zebrafisk har kun tre antistof klasser14, der henviser til, at mennesker har fem15. I mangel af knoglemarven og lymfeknuderne, den primære lymfoide organer i fisk nyre og thymus16 og milten, nyrerne og tarmen tjene som sekundære lymfoide organer17. Trods disse forskelle, med dens fulde immun arsenal af medfødte og adaptive celler, er de voksne zebrafisk en yderst relevant, nem at bruge, ikke-pattedyr model for vært-patogen interaktion undersøgelser.
For zebrafisk er sidst blevet etableret som en mulig model til at studere tuberkulose18,19,20,21,22. Tuberkulose er en luftbåren sygdom forårsaget af Mycobacterium tuberkulose. Ifølge World Health Organization, tuberkulose forårsaget1,7 million dødsfald i 2016 og er den hyppigste årsag til død af en enkelt patogen verdensomspændende23. Mus24,25, kaniner26 og ikke-menneskelige primater27 er det mest kendte dyr modeller i tuberkulose forskning men hvert ansigt deres begrænsninger. Primat model af M. tuberkulose -infektion ligner den menneskelige sygdom mest tæt, men ved hjælp af denne model er begrænset på grund af alvorlige etiske overvejelser. Andre animalske modeller er hæmmet af værtsspecificitet M. tuberkulose , der påvirker sygdommen patologi. Sandsynligvis det største problem i modellering tuberkulose er den bredt spektrum af infektion og sygdom resultater i den menneskelige sygdomme: tuberkulose er en meget heterogen sygdom spænder fra sterilisering immunitet til latente, aktive og reaktiveret infektion28 , som kan være svært at reproducere og model eksperimentelt.
Mycobacterium marinum er en nær slægtning af M. tuberkulose med ~ 3.000 orthologous proteiner med 85% aminosyre identitet29. M. marinum inficerer naturligt zebrafisk producerer granulomer, kendetegnende for tuberkulose, i sit indre organer19,30. I modsætning til andre animalske modeller anvendes i tuberkulose forskning, zebrafisk producerer mange afkom, det kræver kun en begrænset plads og vigtigst, det er neurophysiologically de mindst udviklede hvirveldyr tuberkulose model tilgængelig. Derudover forårsager M. marinum infektion latent infektion, aktiv sygdom eller endda Sterilisation af mykobakterielle infektion i voksen zebrafisk nøje efterligne spektrum af sygdom resultater af menneskelig tuberkulose19, 31 , 32. her, vi beskriver metoder til den eksperimentelle tuberkulose model af voksne zebrafisk ved at indsprøjte M. marinum ind i bughulen og bruge kvantitativ PCR til at måle mykobakterielle belastninger og immunrespons fra zebrafisk vævsprøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en qPCR-baseret program til at måle mykobakterielle belastninger fra DNA ekstraheret fra eksperimentelt inficerede voksne zebrafisk væv. Dette program er baseret på primere designet omkring 16S-23S rRNA interne transskriberede spacer sekvens40. Den totale mykobakterielle belastning i en fisk prøve anslås ved hjælp af en standardkurve, der er fremstillet af DNA ekstraheret fra et kendt antal kulturperler mykobakterier og under forudsætning af at en bakterie har en kopi af de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er blevet støttet af den finske kulturelle fundament (HL), Tampere tuberkulose Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), grundlaget for den finske Anti-tuberkulose Association (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius Foundation (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane og Aatos Erkko Foundation (M.P.) og Finlands Akademi (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo og Jenna Ilomäki er anerkendt for deres tekniske bistand. Forfatterne anerkender Tampere zebrafisk laboratorium for deres service.
Materials
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 ml homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
References
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
- Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
- Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
- Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis–heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
- Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
- Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
- Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
- Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
- Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
- Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
- Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
- Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
- Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
- Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
- Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
- Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
- Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
- Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
- Madigan, M., Martinko, J. . Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish:a practical approach. , (2002).
- Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
- Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
- Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
- Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
- Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
- Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
- Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
- Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).
