結核抗酸菌 marinum感染成人ゼブラフィッシュをモデル化
Summary
その自然の病原体菌 marinumを使用して大人のゼブラフィッシュ モデルひと結核にプロトコルを紹介します。抽出された DNA と感染したゼブラフィッシュの内臓からの RNA は、抗酸菌の合計負荷魚と qPCR で宿主の免疫反応を明らかにする使用できます。
Abstract
結核は現在毎年 170 万の死と 1040 万感染症を引き起こして最悪人間の病原体であります。この細菌への露出は、滅菌感染から積極的に進んで致命的な病気に至るまで人間の広い疾患のスペクトルを発生します。最も一般的な形式は、無症候性ですが、劇症疾患に再アクティブ化する可能性がある潜在的な結核です。アダルト ゼブラフィッシュとその自然の病原体菌 marinum結核の幅広い疾患のスペクトルを研究に該当するモデルであると証明した最近。重要なは、自発的な待機時間再活性化と抗酸菌感染症の適応の免疫反応はこのモデルで学ぶことができます。この記事で大人ゼブラフィッシュ、内臓抗酸菌荷重および量的な PCR によるホストの免疫反応の測定のための核酸の抽出のためのコレクションの実験的感染症法について述べる。社内の開発、 M. marinum –特定の qPCR の試金は非分裂、休止状態または最近死んだ抗酸菌から DNA が検出されるも、伝統的なめっきより敏感。DNA と RNA の両方は同じ個体から抽出した、病気の状態とホストと病原体の遺伝子発現との関係を研究することが可能です。結核成人ゼブラフィッシュ モデルはこうしてホスト病原体の相互作用を研究する、応用性・非哺乳類体内システムとしてそれ自身を示します。
Introduction
ゼブラフィッシュ (動脈分布) は生物医学研究で広く使用されている動物モデル、一般的な脊椎動物の生物学のための受け入れられたモデルです。ゼブラフィッシュひと疾患モデル研究の多くの分野で採用され、感染症や免疫学的いくつか細菌3のウイルス感染4癌1から心疾患2までの障害,5します。 さらに、ゼブラフィッシュ胚の子宮 ex開発したゼブラフィッシュ人気モデル発生生物学6および毒物学7,8。
感染生物学分野を含む研究の多くの分野で光学的に透明なゼブラフィッシュ幼虫はよく使用されます。最初の免疫細胞は、原始マクロファージが検出された9と 24 h ポスト受精 (hpf) 内で表示されます。好中球は、約 33 hpf10を表示する次の免疫細胞です。ゼブラフィッシュ幼虫は感染症の初期段階と適応免疫細胞11の不在で自然免疫の役割を研究するため可能。ただし、アダルト ゼブラフィッシュ機能的適応免疫システムは感染実験のため複雑さの追加レイヤーを提供します。T 細胞は、3 日後に受精12、および B 細胞の機能性抗体を生成することが 4 週間ポスト受精13周り検出できます。大人のゼブラフィッシュは哺乳類の自然免疫と適応免疫のすべての主要なカウンター パートです。魚の immune systems と人間の主な違いは、リンパ組織の解剖学のように同様の抗体アイソタイプで発見されます。ゼブラフィッシュの人間が 5153 つしか抗体クラス14があります。骨髄とリンパ節のない場合は、魚の第一次リンパ器官は脾臓と胸腺16腎臓、腎臓と腸の二次リンパ器官17としています。自然免疫と適応セルその完全免疫の武器とのこれらの相違にもかかわらず大人のゼブラフィッシュは宿主-病原体相互作用の研究のための非常に適用可能な簡単に使用できる、非哺乳類モデルです。
ゼブラフィッシュは、結核18,19,20,21,22を勉強する実行可能なモデルとして確立されている最近。結核は、結核菌によって引き起こされる空気中の病気です。世界保健機関によると、結核は 2016 年に1.7の百万の死を引き起こしたし、単一の病原体世界23死の主要な原因は。マウス24,25、ウサギ26ヒト以外の霊長類27が最も有名な動物モデル各面しますが、結核研究の制限。人間の病気が最も酷似の結核感染症非ひと霊長類モデルがこのモデルを使用して、重大な倫理的配慮のため限定。他の動物モデルは、結核病の病理に影響を与えるの宿主特異性によって妨げられます。おそらく結核をモデリングで最大の問題は人間の病気で感染や病気の結果の広いスペクトル: 結核は潜在的なアクティブ、再アクティブ化された感染症28 への耐性を滅菌に至る非常に異質病気、ハードを再現し、模型実験できます。
結核菌 marinumは、85% のアミノ酸のアイデンティティの29〜 3,000 相同タンパク質と結核の近親です。M. marinumは、ゼブラフィッシュ肉芽腫、その内臓19、30での結核の特徴を作り出す自然感染します。結核の研究で使用される他の動物モデルとは異なりゼブラフィッシュは多くの子孫を作り出す、限られたスペースのみ必要で、重要なは、後発の脊椎結核モデルでは neurophysiologically。M. marinum感染はひと結核19,の病気の結果のスペクトルを密接に模倣した大人のゼブラフィッシュの潜伏感染、アクティブな病や抗酸菌症のも殺菌を引き起こすまた、31,32しますここでは、 M. marinumを腹腔内に注入し、抗酸菌の負荷とゼブラフィッシュから免疫を測定する定量的 PCR を使用して大人のゼブラフィッシュの実験的結核症モデル法について述べる。組織サンプル。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで実験感染成人ゼブラフィッシュ組織から抽出した DNA から抗酸菌の負荷を測定する qPCR ベースのアプリケーションについて述べる。このアプリケーションは、プライマー 16S 23S rRNA スペーサー シーケンス40を中心に設計に基づいています。魚サンプルの全抗酸菌荷重は、培養抗酸菌の知られている数から抽出され、その 1 つの細菌が任意の時点でそのゲノムの 1 つのコ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業によって、フィンランド文化財団 (H.L.)、タンペレ結核財団 (H.L.、l.-m. v.、M.M.H.、m. p.)、フィンランドの結核協会 (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L. の基礎をサポートされていますM.M.H.、m. p.)、ねんどろいど Jusélius 財団 (m. p.)、エミール ・ アールト財団 (M.M.H.)、ジェーンと Aatos Erkko 財団 (融点) とフィンランド アカデミー (融点)。その技術支援のレーナ Mäkinen、ハンナ レーナ ・ ピッポ、ジェナ ・ Ilomäki を認めた著者は、彼らのサービスのタンペレ ゼブラフィッシュ研究室を認めます。
Materials
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 ml homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
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