Индукция атеросклеротических бляшек через активацию рецепторов минералокортикоиды аполипопротеин E-недостаточным мышей
Summary
Мы описываем протокол побудить атеросклероза в корня аорты ароЕ– / – мышей кормили с атерогенные диеты, посредством непрерывного освобождения альдостерона. Также описаны методы характеризовать состав зубного налета.
Abstract
Атеросклероз является из-за хронической воспалительной реакции, затрагивающих эндотелия и способствует ряд факторов, таких как артериальной гипертензии, дислипидемии и сахарного диабета. На сегодняшний день, есть доказательства в поддержку роли для циркулирующих альдостерона как фактор риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Трансгенные мыши модели были созданы для изучения молекулярных и клеточных процессов, ведущих к атеросклероза. В этой рукописи мы описываем протокол, который использует преимущества непрерывной инфузии альдостерона в ароЕ– / – мышей и генерирует атеросклеротических бляшек в корня аорты после 4 недель лечения. Мы, таким образом, иллюстрируют метод количественного определения и характеристики атеросклеротических поражений на уровне корня аорты. Добавленной стоимости альдостерона настой представлена поколения атеросклеротических поражений богатые липидов и воспалительных клеток после 4 недель лечения. Мы подробно описать окрашивание процедуры для количественного определения липидов и макрофагов содержимое налета. В частности в настоящем Протоколе, мы выполняем сердце ткани встраивание в OCT для сохранения антигенностью сердечной ткани и облегчения выявления антигенов интерес. Анализ фенотипа доска представляет собой допустимый подход для изучения патофизиологии развития атеросклероза и выявления роман фармакологических цели в области развития анти атерогенные наркотиков.
Introduction
Атеросклероз является одной из основных причин смертности и заболеваемости во всем мире1. Он характеризуется хронические воспалительные состояния, где кровеносные сосуды находятся проникли липиды и лейкоциты, которые определяют формирование атеросклеротических бляшек. Большинство острых сердечных событий связаны с тромботических вследствие разрыва зубного налета. Мемориальные доски подвержены разрыву определяются «уязвимых» и характеризуются увеличение проникновения провоспалительных лейкоцитов, некротические ядра и тонким волокнистым Кап2. В последние десятилетия клинических и экспериментальных исследований уточнили комплекс Патофизиология болезни. Несколько животных моделей используются для изучения молекулярных механизмов, участвующих в индукции атеросклероза3. В настоящее время мышь является наиболее часто используемых видов для изучения атеросклероза, несмотря на некоторые конкретные виды различий, существующих в патофизиологии по сравнению с людьми. В частности циркулирующих холестерина главным образом состоит из высокоплотного липопротеинов (с антиатерогенными свойствами) в моделях мыши, в то время как в организме человека холестерина циркулирующих транспортируется главным образом как липопротеиды низкой плотности (ЛПНП), вероятно Представляя Главная причина, почему мышах одичал типа не развиваются спонтанное атеросклероза4. Кроме того мышей дикого типа обычно устойчивы к поглощая холестерин из рациона, в то время как люди поглощают около 50% диетического холестерина4. Чтобы преодолеть эти ограничения, были созданы несколько моделей генетически модифицированные мыши. Аполипопротеин E – дефицит мышь (ароЕ−/−) и ЛПНП рецепторов – дефицит мышь (LDLr−/−) широко используются. На высокой жирностью высокий холестерин диета мышей− −/ароЕ развивать налета более быстрыми темпами по сравнению с мышей−LDLr−/, и по этой причине, использование ароЕ мышей− −/ более широко, чем у LDLr/−−мышей5,6. Мышей− −/ароЕ развиться поражения на любой стадии атеросклероза и сопоставимы с теми, которые наблюдались в организме человека, хотя мыши бляшек не показывать нестабильной фенотип7. Как правило мышей− −/ароЕ спонтанно развитие атеросклероза и ускорить этот процесс с западной диете3. Тяжесть атеросклероза может оцениваться на уровне сонных, тромбоэмболии, бедренных и плечеголовной артерии и корня аорты6. В частности корня аорты представляет анатомические сайт, склонны к развитию атеросклеротических поражений у мышей. По этой причине это обычная практика для оценки формирования атеросклеротических бляшек в этом регионе.
Несколько исследований показали, что альдостерон замешан в развитии атеросклероза8,9,10. Настой альдостерона в ароЕ−/− мышей кормили атерогенные диета ускоряет развитие корня аорты атеросклеротических поражений, вызывая воспаление и липидов богатых налета формирования10.
В целом мы описываем протокол, включая альдостерона инфузии, атерогенные диета питание, встраивание тканей сердца, количественной оценки и характеристики атеросклеротических поражений в ароЕ– / – мышей. Эта процедура способствует эффективное формирование воспаленной, липидов богатых атеросклеротических бляшек и представляет собой ценный модель для изучения атерогенеза.
Protocol
Representative Results
Discussion
Атеросклероз является хроническим воспалительным расстройства, связанные с крупных и средних судов с участием взаимодействий между несколькими типами клеток, такие как макрофаги, Т-лимфоциты, эндотелиальные клетки и гладкомышечные клетки1. Несмотря на ограничения мышин?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана от грантов от итальянского министерства здравоохранения (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 и PE-2011-02347070 для м.к.)
Materials
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
References
- Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
- Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease?. Current Opinion in Lipidology. 21 (5), 434-440 (2010).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Do the Apoe-/- and Ldlr-/- Mice Yield the Same Insight on Atherogenesis?. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1734-1741 (2016).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Schwartz, S. M., Galis, Z. S., Rosenfeld, M. E., Falk, E. Plaque rupture in humans and mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 705-713 (2007).
- de Rita, O., Hackam, D. G., Spence, J. D. Effects of aldosterone on human atherosclerosis: plasma aldosterone and progression of carotid plaque. Canadian Journal of Cardiology. 28 (6), 706-711 (2012).
- Ivanes, F., et al. Aldosterone, mortality, and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure. European Heart Journal. 33 (2), 191-202 (2012).
- McGraw, A. P., et al. Aldosterone increases early atherosclerosis and promotes plaque inflammation through a placental growth factor-dependent mechanism. Journal of the American Heart Association. 2 (1), e000018 (2013).
- Rittie, L. Method for Picrosirius Red-Polarization Detection of Collagen Fibers in Tissue Sections. Methods in Molecular Biology. 1627, 395-407 (2017).
- Caprio, M., et al. Functional mineralocorticoid receptors in human vascular endothelial cells regulate intercellular adhesion molecule-1 expression and promote leukocyte adhesion. Circulation Research. 102 (11), 1359-1367 (2008).
- Marzolla, V., et al. Essential role of ICAM-1 in aldosterone-induced atherosclerosis. International Journal of Cardiology. 232, 233-242 (2017).
