בידוד של שלפוחית חוץ-תאי של נוזל שטיפה Bronchoalveolar מאתר באמצעות טכניקת צנטריפוגה אולטראפילטרציה
Summary
כאן, אנו מתארים שני שלפוחית חוץ-תאית בידוד םילוקוטורפ אולטראפילטרציה צנטריפוגה, ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות, לבודד שלפוחית חוץ-תאית מדגימות נוזלים שטיפה bronchoalveolar מאתר. השלפוחיות המוגלתיות חוץ-תאית נגזר נוזל שטיפת מאתר bronchoalveolar על ידי שתי השיטות לכמת, מאופיין.
Abstract
חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם מרכיבים subcellular שהתגלתה לשחק תפקידים חשובים רבים ביולוגית איתות פונקציות במהלך מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. בידודו של EVs ממשיכה להיות אתגר גדול בתחום זה, בשל מגבלות מהותי כל טכניקה. Ultracentrifugation דיפרנציאלי בשיטה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות היא גישה נפוץ והוא נחשב להיות ההליך תקן הזהב לבידוד EV. עם זאת, הליך זה גוזלת זמן, עתירי עבודה, ותוצאות בדרך כלל מדרגיות נמוכה, אשר ייתכן שלא יתאים לדוגמאות בנפח מצומצם כמו נוזל שטיפה bronchoalveolar. נדגים שיטה בידוד אולטראפילטרציה צנטריפוגה היא פשוטה וזה ואת העבודה-היעילה עדיין מספקת תשואה גבוהה טוהר. אנו מציעים כי שיטה זו בידוד יכול להיות גישה חלופית מתאימה לבידוד EV, במיוחד עבור דגימות ביולוגיות בנפח מצומצם.
Introduction
Exosomes המשנה הקטן ביותר של EVs, 50 – 200 ננומטר בקוטר, יש מספר תפקודים ביולוגיים על פני מערך מגוון של איתות תהליכים1,2,3,4,5. הם חלים על הומאוסטזיס הסלולר ורקמות בעיקר על ידי הקלת תקשורת המערכת באמצעות מטען מולקולות כמו שומנים, חלבונים וחומצות גרעין6,7,8,9 . צעד קריטי במחקר EV הוא תהליך בידוד. Ultracentrifugation דיפרנציאלית (UC), עם או בלי צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (DGC), נחשב הגישה תקן זהב, אך שיטה זו נושאת מגבלות הגדולות, כולל המחירים לא יעיל של שחזור EV, מדרגיות נמוכה10 , 11 , 12, זה להגביל את הניצול הטוב ביותר כדי דגימות נפח גדול יותר, כגון תא תרבות exosome supernatant או גבוהה ייצור דגימות. היתרונות והחסרונות של שיטות אחרות, כגון גודל הדרה אולטראפילטרציה או כרומטוגרפיה, בידוד immunoaffinity על-ידי חרוזים או עמודות ולאחר מיקרופלואידיקה, מתוארים היטב, נהלים משלימה המודרנית פותחו כדי להתגבר על ולצמצם את מגבלות טכניות כל גישה11,12,13,14,15. אחרים הראו כי צנטריפוגה אולטראפילטרציה (UFC) עם קרום nanoporous ביחידה מסנן הוא טכניקה חלופית המספק טוהר דומות ל UC שיטת16,17,18. טכניקה זו יכולה להיחשב באחת השיטות בידוד חלופי.
נוזל שטיפה Bronchoalveolar (BALF) מכיל EVs שקיימים מספר תפקודים ביולוגיים שונים מערכת הנשימה תנאים19,20,21,22. לומדת EVs BALF-derived כרוך כמה אתגרים בשל invasiveness של ההליך ברונכוסקופיה אצל בני אדם, כמו גם כמות מוגבלת של שחזור נוזל שטיפה. בחיות מעבדה קטנה כגון עכברים, רק כמה מיליליטר ניתן לשחזר בתנאי ריאות רגילה, אפילו פחות הריאות מודלק או שהותירה23. כתוצאה מכך, איסוף כמות מספקת של BALF EV בידוד על ידי ultracentrifugation דיפרנציאלי עבור יישומי הזרם לא יכול להיות ריאלי. אולם, בידוד אוכלוסיות EV הנכון הוא גורם מכריע ללמוד תפקודים ביולוגיים EV. האיזון העדין בין היעילות ומועילות ימשיך להיות אתגר בשיטות בידוד ומבוססת EV.
במחקר הנוכחי, נדגים כי בגישה אולטראפילטרציה צנטריפוגלי, ניצול 100 kDa משקל מולקולרי ניתוק (MWCO) nanomembrane מסנן יחידה, מתאים בנפח מצומצם דגימה ביולוגית כגון BALF. טכניקה זו פשוטה, יעילה, ומספק טוהר גבוהה ומדרגיות לתמוך המחקר של EVs נגזר BALF.
Protocol
Representative Results
Discussion
ב העשורים האחרונים, מדענים יש פרם את חשיבות של EVs בהומאוסטזיס הסלולר. וחשוב מכך, EVs לשחק תפקידים עיקריים בתהליכים רבים של המחלה על ידי להתכוונן תאים שכנים ומרוחק דרך שלהם מטען ביואקטיביות מולקולות1,21,22,26,27…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכת על ידי את NHLBI/NIH מענקים HL103868 (P.C.) ו HL137076 (כדי P.C.), את האמריקאי הלב האגודה מענק הסיוע (כדי P.C.) את פרס מחקר סמואל Oschin מקיף סרטן המכון (SOCCI) סרטן ריאות (כדי P.C.). ברצוננו להביע הערכה גדולה מכון הלב Smidt במרכז הרפואי Cedars-Sinai המספק לנו מכונה Nanosight EV nanoparticle מעקב ניתוח.
Materials
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | – | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | – | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | – | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | – | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | – | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
- Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
- Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
- Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
- Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
- Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
- Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. 암 연구학. 77 (9), 2306-2317 (2017).
- Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
- Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
- Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
- Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
- Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
- Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
- Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS – Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
- Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
- Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).
