Isolierung der extrazellulären Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid eine Ultrafiltration Zentrifugation Technik

Summary

Hier beschreiben wir zwei extrazellulären Vesikel Isolierung Protokolle, Ultrafiltration Zentrifugation und Ultrazentrifugation mit Dichte Steigung Zentrifugierung, extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Flüssigkeitsproben zu isolieren. Die extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid durch beide Methoden abgeleitet werden quantifiziert und charakterisiert.

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind neu entdeckte subzelluläre Komponenten, die in vielen biologischen Funktionen während physiologische und pathologische Zustände signalisieren eine wichtige Rolle spielen. Die Isolation der EVs nach wie vor eine große Herausforderung in diesem Bereich aufgrund von Einschränkungen für jede Technik. Die differentielle Ultrazentrifugation mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung-Methode ist eine häufig verwendete Ansatz und gilt als der Goldstandard-Verfahren für EV Isolation. Dieses Verfahren ist jedoch zeitaufwendig, arbeitsintensiv, und in der Regel führt zu niedrigen Skalierbarkeit, die möglicherweise nicht geeignet für kleinvolumige Proben wie alvéolaire Lavage-Flüssigkeit. Wir zeigen, dass eine Ultrafiltration Zentrifugierung isoliert Methode einfach ist und doch Zeit und Arbeit-effiziente eine hohe Rückgewinnung Ausbeute und Reinheit bietet. Wir schlagen vor, diese Isolationsmethode ein alternativer Ansatz sein könnte, der sich für EV Isolation, besonders für kleinvolumige biologischen Proben eignet.

Introduction

Exosomen sind die kleinste Teilmenge des EFD, 50 – 200 nm im Durchmesser, und haben mehrere biologische Funktionen über eine Vielzahl von Prozessen^1,2,3,4,5-Signalisierung. Sie regieren Mobilfunk- und Gewebe Homöostase in erster Linie durch Erleichterung der interzellulären Kommunikation durch Ladung Moleküle wie Lipide, Proteine und Nukleinsäuren^6,7,8,9 . Ein entscheidender Schritt in der EV-Forschung ist die Isolierung-Prozess. Differenzielle Ultrazentrifugation (UC), mit oder ohne Dichte Gradienten Zentrifugation (DGC), gilt als des Goldstandard Ansatzes, aber diese Methode trägt wesentliche Einschränkungen, wie ineffizient EV Wiederfindungsraten und geringe Skalierbarkeit^{10 , 11 , 12}, einschränken, seine beste Auslastung zu größeren Volumen Proben, wie Zelle Kultur überstand oder hohe Exosom Produktion Proben. Die vor- und Nachteile von anderen Methoden, wie z. B. Größe Ausgrenzung durch Ultrafiltration oder Chromatographie, Immunoaffinitäts Isolierung von Perlen oder Spalten und Mikrofluidik, sind gut beschrieben und moderne ergänzende Verfahren wurden entwickelt, um einen zu überwinden Sie und minimieren Sie technische Einschränkungen in jedem Ansatz^{11,12,13,14,15}. Andere haben gezeigt, dass eine Ultrafiltration Zentrifugation (UFC) mit einem nanoporösen Membran in der Filtereinheit ist eine alternative Technik, die vergleichbare Reinheit eine UC-Methode^16,17,18liefert. Diese Technik könnte als eine der alternativen Isolierung Methoden betrachtet werden.

Alvéolaire Lavage-Flüssigkeit (BALF) enthält EVs, die zahlreiche biologische Funktionen in verschiedenen Atemwegserkrankungen^19,20,21,22besitzen. Studieren BALF abgeleitet EVs bringt einige Herausforderungen aufgrund der Invasivität der Bronchoskopie Verfahren beim Menschen, sowie eine begrenzte Anzahl von Lavage Fluid Erholung. Im kleinen Labortiere wie Mäuse nur wenige Milliliter im normalen Lungenerkrankungen zurückgewonnen werden, noch weniger entzündeten oder fibrotische Lungen²³. Infolgedessen kann das Sammeln einer ausreichenden Menge an BALF EV Isolation durch eine differenzierte Ultrazentrifugation für downstream-Anwendungen nicht möglich sein. Richtige EV Bevölkerung zu isolieren ist jedoch ein entscheidender Faktor für das Studium EV biologischer Funktionen. Das empfindliche Gleichgewicht zwischen Effizienz und Effektivität nach wie vor eine Herausforderung in etablierten EV Isolationsmethoden.

In dieser aktuellen Studie zeigen wir, dass ein zentrifugale Ultrafiltration Ansatz, unter Verwendung einer 100 kDa Molekulargewicht Cut-Off (MWCO) Nanomembrane Filtereinheit, für kleinvolumige biologische Proben wie BALF geeignet ist. Diese Technik ist einfach, effizient und sorgt für hohe Reinheit und Skalierbarkeit zur Unterstützung der Studie des EFD BALF abgeleitet.

Protocol

Die Nutzung von Tieren und alle tierischen Verfahren wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschüsse (IACUC) am Cedars-Sinai Medical Center (CSMC) genehmigt. (1) murinen alvéolaire Lavage Fluid (BALF) Sammlung und Aufbereitung BALF Sammlung Einschläfern Sie Mäuse mit einem Cocktail von Ketamin (300 mg/kg) und Xylazin (30 mg/kg) über die intraperitoneale Route gefolgt von zervikale Dislokation. Legen Sie eine 22 G Angiocatheter in der Luftrö…

Representative Results

Wir führten EV Isolation aus Maus BALF Methoden UFC und UC-DGC Isolierung am selben Tag. Die UFC-Methode benötigt ca. 2,5-3 h, während die UC-DGC-Technik 8 h Verarbeitungszeit erforderlich. Dies beinhaltete nicht Puffern und Reagenz Vorbereitungszeit. Es sei darauf hingewiesen, dass einige andere Aufgaben während der Zentrifugation lange Perioden durchgeführt werden konnte. Die gesamte Prozedur dauerte jedoch fast einen ganzen Tag für die UC-DGC-Isolierung-Technik. <p class="jov…

Discussion

In den letzten Jahrzehnten haben Wissenschaftler die Bedeutungen der EVs in zelluläre Homöostase entwirrt. Noch wichtiger ist, spielen die EVs Hauptrollen in vielen Krankheitsprozessen durch Modulation der benachbarten und weit entfernten Zellen durch ihre Ladung bioaktiven Moleküle^{1,21,22,26,27 , 28 ,} <sup clas…

Materials

Material
Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	UFC910024
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Corning Cellgro, Manassas, VA	21-031-CV
Sucrose	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	EMD8550
HEPES	Research Products International, Prospect, IL	75277-39-3
EDTA	Corning Cellgro, Manassas, VA	46-034-CI
Sodium Chloride	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	S3014-1KG
OptiPrep	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	MKCD9753	Density Gradient Medium
Ketamine	VetOne, Boise, ID	13985-702-10
Xylazine	Akorn Animal Health, Lake Forest, IL	59399-110-20
Syringe 1 mL	BD Syringe, Franklin Lakes, NJ	309656
Angiocatheter 20G	BD Syringe, Franklin Lakes, NJ	381703
Centrifuge tubes 15 mL	VWR, Radnor, PA	89039-666
Centrifuge tubes 50 mL	Corning Cellgro, Manassas, VA	430828
Bicinchonic acid (BCA) protein assay	Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL	23235
Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody	AbCam, Cambridge, MA	AB125011
Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody	Biolegend, San Diego, CA	143904
CD81
CD9
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	7074S
4x LDS
10x Reducing agent (Bolt)
10x Lysis buffer (Bolt)	Cell Signaling Technology, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	NW04120
iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	IB23002
Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO	Denville Scientific, Holliston, MA	E2400
Ultracentrifuge tubes 17 mL	Beckman Coulter, Pasadena, CA	337986
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL	Beckman Coulter, Pasadena, CA	326823
Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	09-754-13
Equipment
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany	–
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, Pasadena, CA	–
Nanosight (NS300)	Malvern, Worcestershire, UK	–	To measure particle size distribution and particle concentration
MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	–
iBlot Transfer Apparatus	Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA	–
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10			Analysis software