Summary

Rilevamento e isolamento di corpi apoptotici di elevata purezza

Published: August 12, 2018
doi:

Summary

Un flusso di lavoro utilizzando una centrifuga di flusso cytometry o differenziale è stato sviluppato per individuare, quantificare e isolare i corpi apoptotici da un campione di apoptotic di elevata purezza.

Abstract

I membri principali della famiglia delle vescicole extracellulari, con ApoBDs essendo uno del più grande tipo di corpi apoptotici (ApoBDs), microvescicole ed esosomi. È stato proposto che ApoBDs può aiutare la liquidazione delle cellule, come pure la comunicazione intercellulare attraverso traffico biomolecole. Gli approcci convenzionali utilizzati per l’identificazione e l’isolamento di ApoBDs sono spesso limitati dalla mancanza di quantificazione accurata e purezza basso del campione. Qui, descriviamo un flusso di lavoro per confermare l’induzione di apoptosi, convalidare ApoBD formazione e isolare ApoBDs di elevata purezza. Inoltre, contorni e confrontare approcci di centrifugazione differenziale basato per isolare ApoBDs e fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS). Inoltre, la purezza del ApoBDs isolato verrà confermata utilizzando un stabilire in precedenza flusso cytometry-based colorazione e metodo analitico. Presi insieme, utilizzando l’approccio descritto, THP-1 del monocito apoptosi e apoptotica delle cellule lo smontaggio è stato indotto e validato, e ApoBD generati dai monociti THP-1 sono stati isolati per una purezza del 97-99%.

Introduction

Apoptosi, una forma ben studiata di morte cellulare programmata, sono necessaria per mantenere l’omeostasi fisiologica e rimuovere le cellule potenzialmente dannose all’interno del corpo umano1. Dopo l’induzione dell’apoptosi, cellule apoptotiche (ApoCells) possono subire una serie di cambiamenti morfologici e smontare in piccole vescicole di membrana-limita, chiamate ApoBDs. Nel complesso, questo processo è noto come smontaggio delle cellule apoptotiche e può essere diviso in 3 fasi distinte sulla base di morfologia2,3. Passaggio 1 (membrana plasmatica blebbing) è caratterizzata dalla formazione di aerostato-come le strutture sulla superficie delle cellule, noto come vescichette4,5. Passaggio 2 (formazione di protrusione apoptotici) comprende la formazione di protrusioni di membrana lungo come apoptopodia, apoptopodia in rilievo e microtubuli picchi6,7,8. Infine, passo 3 (formazione di ApoBD) include la frammentazione apoptotica protrusioni e/o ApoCells per generare ApoBDs6,9. I risultati precedenti hanno suggerito un ruolo di ApoBDs in favoreggiamento liquidazione delle cellule apoptotiche e mediare la comunicazione intercellulare. Ad esempio, si propone che la frammentazione di un ApoCell in ApoBDs può generare piccoli pezzi ‘bite-sized’ che potrebbero essere facilmente rimossi da circostante fagociti2,10,11. Inoltre, ApoBDs può harbor una serie di biomolecole quali DNA, RNA e proteine, che possono essere vittime di tratta a cellule circostanti per facilitare cella comunicazione12,13,14. Per funzionalmente studiare questi processi, è fondamentale per confermare tre parametri chiave, tra cui (i) validazione di induzione di apoptosi e ApoBD formazione, (ii) isolamento di ApoBDs e (iii) la conferma dell’ApoBD purezza.

In precedenza, una serie di metodi tra cui citofluorimetria e microscopia elettronica è stata usata per studiare l’apoptosi e ApoBDs15,16,17,18. Tuttavia, quantificazione e rilevamento di ApoBD sono spesso difficili o trascurato. Per esempio, l’apoptosi di base di citometria a flusso più ordinariamente utilizzati test impiega Annessina V (A5, una proteina che lega l’esternalizzati ‘ mangiare-me’ segnale fosfatidilserina (PtdSer)) e dell’acido nucleico macchia propidio ioduro (PI)19. Tuttavia, con questa combinazione di macchia universale, analisi presuppone che ci sono solo tre tipi di sottoinsiemi di cellule (cellule vitali, ApoCells e cellule necrotiche) nel campione. Inoltre, anche se considerata come “gold standard” da molti ricercatori per apoptosi, analisi di citometria a flusso e l’analisi successiva dei dati spesso esclude ApoBDs attraverso un passaggio di gating iniziale selezionando eventiintermedio-alto FSC/SSC. Di conseguenza, abbiamo recentemente sviluppato un’analisi di citometria a flusso romanzo usando A5 e TO-PRO-3, un’altra macchia di acido nucleico che può essere preso in modo selettivo di caspase 3/7-attivato Pannexina 1 (PANX1) canali7,20. Come attivazione di caspase 3-induced PANX1 precede l’esposizione PtdSer nella fase iniziale dell’apoptosi, TO-PRO-3 macchie differenzialmente apoptotici e cellule necrotiche. Inoltre, questo approccio combinato con il nostro romanzo gating strategia include eventi tutti acquisiti durante l’analisi dei dati e di conseguenza, sei sottoinsiemi di cellule/particella sono identificati, tra cui: (i) cellule vitali (FSC/SSCintermedio/alto, A5basso , A-PRO-3bassa), (ii) A5 primi ApoCells (FSC/SSCintermedio/alto, A5basso, TO-PRO-3intermedi), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCintermedio/alto, A5alta , A-PRO-3intermedi), cellule necrotiche (iv) o tardo ApoCells (FSC/SSCintermedio/alto, A5alta, TO-PRO-3alta), (v) ApoBDs (FSC/SSCbasso, A5intermedi, a-PRO-3basso / intermedio) e (vi) detriti (FSC/SSCbasso, A5basso, TO-PRO-3basso)20. Il nostro approccio sottolinea l’importanza di analizzare tutti i sottoinsiemi di cellule/particella e, cosa ancora più importante, la separazione di ApoBDs dalle cellule e detriti20. Quindi, questo approccio dimostra una tecnica efficace per convalidare l’induzione di apoptosi e ApoBD formazione simultaneamente.

Tradizionalmente, i ApoBDs sono stati isolati attraverso una varietà di approcci di centrifugazione differenziale per cui ApoBDs può essere separato dalle cellule o altre vescicole extracellulari in base alla densità. Tuttavia, tali metodi di centrifugazione sono spesso limitati dalla bassa ApoBD purezza, mancanza di una fase di quantificazione per confermare la purezza del campione e/o incapacità di separare cella tipo-specific ApoBDs17,21,22. Di conseguenza, abbiamo sviluppato recentemente due approcci, basati su FACS e un nuovo approccio differenziale basato su centrifugazione che può essere accoppiato con il nostro metodo di citometria a flusso precedentemente stabilito per convalidare l’induzione di apoptosi e campione purezza23. ApoBD isolamento tramite nostro approccio basato su FACS può arricchire ApoBDs fino a 99% di purezza e può essere accoppiato con una varietà di anticorpi specifici del tipo delle cellule per isolare ApoBDs da popolazioni di cellule miste, campioni di tessuti e fluidi corporei23. Inoltre, il nostro approccio riveduto centrifugazione differenziale viene illustrato un metodo efficiente per isolare ApoBDs a > 90% purezza23.

In questo articolo, descriviamo dettagliatamente la nostra procedura sperimentale per convalidare l’induzione di apoptosi e per rilevare e quantificare ApoBD formazione. I flussi di lavoro di isolamento ApoBD utilizzando metodi basati su centrifugazione differenziali e basati su FACS anche elaborati e confrontati. I dati rappresentativi dimostrano che la metodologia descritta fornisce un efficace strumento all’avanguardia per gli studi futuri di ApoBD.

Protocol

1. induzione di apoptosi Centrifugare il campione di cellule a 300 x g per 5 min ed eliminare il surnatante per rimuovere eventuali detriti cellulari pre-esistenti.Nota: Quando si utilizza cellule aderenti, cellule del seme in anticipo e lavare con soluzione tampone fosfato (PBS) prima di induzione di apoptosi: 1x. Determinare il numero di cell e raccogliere le cellule.Nota: A seconda post-dell’isolamento di test, si consiglia un numero di cellulare iniziale di almeno 1 x 107 cellul…

Representative Results

Utilizzando la procedura descritta qui, è stato indotto apoptosi monociti THP-1 e ApoBDs sono stati rilevati e isolato tramite un FACS-based o un approccio di centrifugazione differenziale (Figura 1). In primo luogo, l’apoptosi è stata indotta da irradiazione UV e campioni sono stati raccolti dopo 2-3 h di incubazione, quando le cellule hanno esibito apoptotica morfologie, compreso blebbing, formazione di protrusione della membrana apoptotici e la generazio…

Discussion

Dalla sua descrizione iniziale nel 1950, il campo dell’apoptosi ha avanzato notevolmente, diventando una zona prominenti di ricerca. Nonostante il vasto interesse e gli sforzi profusi, alcuni aspetti dell’apoptosi, in particolare la formazione di ApoBDs, non sono stati studiati bene a causa della mancanza di adeguate metodologie. Queste comprendono in particolare la limitazione in progressione di apoptosi e ApoBD formazione contemporaneamente usando la citometria a flusso tradizionale analisi A5/PI e le impurità di isol…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo ha funzionato è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Health e il Medical Research Council (GNT1125033 e GNT1140187) e Australian Research Council (DP170103790) a I.K.H.P.

Materials

Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) ATCC
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Penicillin-streptomycin mixture Life Technologies 15140122
FSC Gibco 10099-141
1x PBS
Annexin V FITC BD Bioscience
TO-PRO-3 iodide Life Technologies T3605 TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact.
10x Annexin V binding buffer BD Bioscience 556454
EDTA Sigma-Aldrich 1001710526
Centrifuge tube (15 mL) Cellstar 188271
Microcentrifuge tube (1.5 mL) Sarstedt 72.690.001
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2)
Centrifuge Beckman Coulter 392932
FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience
FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience
FACS Diva 6.1.1 software BD Bioscience
FlowJo 8.8.6 software
 UV Stratalinker 1800 Stratagene

References

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Cite This Article
Phan, T. K., Poon, I. K., Atkin-Smith, G. K. Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity. J. Vis. Exp. (138), e58317, doi:10.3791/58317 (2018).

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