Detección y aislamiento de cuerpos apoptóticos de alta pureza
Summary
Un flujo de trabajo mediante centrifugación de flujo cytometry o diferencial se desarrolla para detectar, cuantificar y aislar cuerpos apoptóticos de una muestra de apoptotic de alta pureza.
Abstract
Cuerpos apoptóticos (ApoBDs), microvesículas y exosomas son los miembros clave de la familia de vesículas extracelulares, con ApoBDs siendo uno del tipo más grande. Se ha propuesto que puede ayudar a ApoBDs celular separación así como la comunicación intercelular a través de biomoléculas de la trata de personas. Enfoques convencionales para la identificación y aislamiento de ApoBDs a menudo están limitados por la falta de cuantificación precisa y muestra baja pureza. Aquí, describimos un flujo de trabajo para confirmar la inducción de apoptosis, validar la formación ApoBD y aislar ApoBDs de alta pureza. También esbozar y comparar celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación y centrifugación diferencial basado en enfoques para aislar ApoBDs. Además, la pureza de ApoBDs aislados se confirmará mediante una previamente establecer flujo cytometry basado en coloración y método analítico. Tomados en conjunto, utilizando el enfoque descrito, THP-1 Desmontaje de monocitos apoptotic y la apoptosis celular fue inducida y validado, y ApoBD generado a partir de monocitos THP-1 fueron aisladas a una pureza de 97-99%.
Introduction
Apoptosis, una forma bien estudiada de muerte celular programada, es necesaria para mantener la homeostasis fisiológica y eliminar células potencialmente dañinas en el cuerpo humano1. Después de la inducción de la apoptosis, las células apoptotic (ApoCells) pueden someterse a una serie de cambios morfológicos y desmontar en pequeñas vesículas de membrana denominadas ApoBDs. En general, este proceso se conoce como desmontaje de la célula apoptótica y puede dividirse en 3 pasos distintos basados en morfología2,3. Paso 1 (membrana del plasma blebbing) se caracteriza por la formación de globo-como las estructuras en la superficie de la célula conocido como ampollas4,5. Paso 2 (formación de protusión apoptóticos) incluye la formación de protrusiones de membrana larga como apoptopodia, apoptopodia de cuentas y microtúbulos picos6,7,8. Por último, el paso 3 (formación ApoBD) incluye la fragmentación de la apoptosis protuberancias o ApoCells para generar ApoBDs6,9. Los resultados anteriores han sugerido un papel de ApoBDs en ayudar a la separación de células apoptotic y mediar la comunicación intercelular. Por ejemplo, se propone que la fragmentación de un ApoCell en ApoBDs puede generar pequeñas cantidades de ‘pequeñas’ que podrían eliminarse fácilmente rodeando los fagocitos2,10,11. Además, ApoBDs puede albergar una serie de biomoléculas como el DNA, RNA y proteínas, que pueden ser víctimas de la trata a las células circundantes para facilitar la comunicación de célula12,13,14. Para funcionalmente investigar estos procesos, es vital para confirmar tres parámetros fundamentales, incluyendo (i) validación de inducción de apoptosis y la formación de ApoBD, (ii) aislamiento de ApoBDs y (iii) confirmación de pureza ApoBD.
Previamente, una serie de métodos como citometría de flujo y microscopia electrónica se ha utilizado para estudiar la apoptosis y ApoBDs15,16,17,18. Sin embargo, cuantificación y detección de ApoBD son a menudo difíciles o se pasa por alto. Por ejemplo, la apoptosis basados en citometría de flujo del utilizan más habitualmente análisis emplea anexina V (A5, una proteína que se une el externalizados ‘ comer-me’ señal fosfatidilserina (PtdSer)) y ácidos nucleicos de la mancha (PI) el yoduro de propidio19. Sin embargo, mediante el uso de esta combinación de tinte universal, análisis asume que hay solamente tres tipos de subconjuntos de la célula (células viables, ApoCells y células necróticas) en la muestra. Además, aunque se considera como “estándar de oro” por muchos investigadores para apoptosis, ensayos de citometría de flujo y análisis de datos posteriores a menudo excluyen ApoBDs a través de un primer paso bloquea seleccionar eventos deintermedio-alto FSC/SSC. Por ello, recientemente hemos desarrollado un análisis de citometría de flujo novela con A5 y PRO-TO-3, otra mancha nucleico que puede ser selectivamente tomada por caspasas 3/7-activa pannexin 1 (PANX1) canales7,20. Como la activación de caspasas inducida por 3 PANX1 precede PtdSer exposición en la etapa temprana de la apoptosis, TO-PRO-3 manchas diferencialmente apoptotic y células necróticas. Además, este acercamiento combinado con nuestra novela gating estrategia incluye eventos todos adquiridos durante el análisis de datos y como resultado, se identifican seis subconjuntos de la célula/de la partícula, incluyendo: (i) las células viables (FSC/SSCintermedio/alto, A5bajo , TO-PRO-3bajo), (ii) A5– ApoCells temprano (FSC/SSCintermedio/alto, A5bajo,intermedioPRO-TO-3), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCintermedio/alto, A5alta , TO-PRO-3intermedia), células necróticas (iv) o ApoCells finales (FSC/SSCintermedio/alto, A5alta,altaTO-PRO-3), (v) ApoBDs (FSC/SSCbaja, A5intermedio, TO-PRO-3bajo / intermedio) y (vi) escombros (FSC/SSCbajo, A5bajo,bajaPRO-TO-3)20. Nuestro enfoque destaca la importancia de analizar todos los subconjuntos de células/partícula y, más importante aún, la separación de ApoBDs de las células y desechos20. Por lo tanto, este enfoque demuestra una técnica eficiente para validar la inducción de la apoptosis y ApoBD formación simultáneamente.
Tradicionalmente, ApoBDs han sido aislados a través de una variedad de métodos de centrifugación diferencial por el que ApoBDs se puede separar de las células u otras vesículas extracelulares basadas en densidad. Sin embargo, tales métodos de centrifugación a menudo están limitadas por la baja ApoBD pureza, falta de un paso de cuantificación para confirmar la pureza de la muestra, o incapacidad para separar células específicas del tipo ApoBDs17,21,22. Por lo tanto, hemos desarrollado recientemente dos enfoques, basados en un FACS y un nuevo enfoque basado en la centrifugación diferencial que puede ser juntado con nuestro método de citometría de flujo previamente establecido para validar la inducción de apoptosis y muestra pureza23. Aislamiento de ApoBD a través de nuestro enfoque basado en el FACS puede enriquecer ApoBDs hasta 99% de pureza y puede acoplarse con una variedad de anticuerpos de tipo específico para aislar ApoBDs de poblaciones de células mixtas, muestras de tejidos y fluidos corporales23. Además, nuestro enfoque de centrifugación diferencial revisado demuestra un método eficiente para aislar ApoBDs al > 90% pureza23.
En este papel, describimos en detalle nuestro procedimiento experimental para validar la inducción de apoptosis y para detectar y cuantificar la formación de ApoBD. Los flujos de trabajo de aislamiento de ApoBD métodos basados en FACS y diferencial basado en la centrifugación también son elaborados y comparados. Los datos representativos demuestran que la metodología descrita proporciona una eficaz herramienta de vanguardia para estudios futuros de ApoBD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desde su primera descripción en la década de 1950, el campo de la apoptosis ha avanzado notablemente, convirtiéndose en un área de investigación prominentes. A pesar del interés general y grandes esfuerzos, ciertos aspectos de la apoptosis, en particular la formación de ApoBDs, no han sido bien estudiados debido a la falta de metodologías apropiadas. Estos incluyen en particular la limitación en el seguimiento de la progresión de la apoptosis y la formación de ApoBD simultáneamente utilizando la citometría d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de salud nacional y Consejo de investigación médica (GNT1125033 y GNT1140187) y Australian Research Council (DP170103790) a I.K.H.P.
Materials
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | – | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | – | – | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | – | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | – | – | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | – | |
| FlowJo 8.8.6 software | – | – | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | – |
References
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
- Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
- Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
- Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
- Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
- Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
- Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
- Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
- Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
- Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
- Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
- Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
- Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
- Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
- Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
- Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
