Laminectomy et implantation de fenêtre de moelle épinière dans la souris
Summary
Ce protocole décrit l’implantation d’une fenêtre en verre sur la moelle épinière d’une souris pour faciliter la visualisation par microscopie intravitale.
Abstract
Ce protocole décrit une méthode pour la laminectomy de moelle épinière et l’implantation de fenêtre en verre pour l’imagerie in vivo de la moelle épinière de souris. Un vaporisateur numérique intégré est utilisé pour obtenir un plan stable d’anesthésie à un faible débit d’isoflurane. Une seule colonne vertébrale vertébrale vertébrale est enlevée, et un verre de couverture disponible dans le commerce est recouvert sur un lit agarose mince. Une plaque arrière en plastique imprimée en 3D est ensuite apposée sur les épines vertébrales adjacentes à l’aide d’adhésif tissulaire et de ciment dentaire. Une plate-forme de stabilisation est utilisée pour réduire l’artefact de mouvement de la respiration et du rythme cardiaque. Cette méthode rapide et sans pinces est bien adaptée pour la microscopie à fluorescence multiphoton. Des données représentatives sont incluses pour une application de cette technique à la microscopie à deux photons de la vascularisation de la moelle épinière chez des souris transgéniques exprimant eGFP:Claudin-5 — une protéine de jonction serrée.
Introduction
Les modèles animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes, lorsqu’ils sont combinés avec la microscopie intravitale, fournissent une plate-forme puissante pour aborder la biologie et la pathophysiologie. Pour appliquer ces techniques à la moelle épinière, des protocoles spécialisés sont nécessaires pour préparer la moelle épinière à l’imagerie. Une telle stratégie est de mener une laminectomy et l’implantation de fenêtre de moelle épinière. Les principales caractéristiques d’un protocole idéal de laminectomy pour la microscopie incluent la conservation de la structure et de la fonction indigènes de tissu, la stabilité du champ de formation image, le temps rapide de traitement, et la reproductibilité des résultats. Un défi particulier est de stabiliser le champ d’imagerie contre le mouvement induit par la respiration et le rythme cardiaque. Plusieurs stratégies ex vivo et in vivo ont été signalées pour atteindre ces objectifs1,2,3,4,5. La plupart des méthodes in vivo impliquent le serrage des côtés de la colonne vertébrale2,4 et est souvent suivie par l’implantation d’un appareil métallique rigide3,4 pour la stabilité pendant la chirurgie et applications d’imagerie en aval. Le clampage de la colonne vertébrale peut potentiellement compromettre le flux sanguin et induire la barrière hémato-encéphalique (BBB) remodelage des protéines.
Le but de cette méthode est de rendre la moelle épinière intacte disponible pour l’imagerie optique chez la souris vivante tout en minimisant l’invasivité du protocole et en améliorant les résultats. Nous décrivons une procédure simple de laminectomy et de couverture-verre d’implantation jumelée à une plaque arrière en plastique ovale mini-invasive 3D-imprimée qui réalise toujours la stabilité mécanique robuste. La plaque arrière est directement adhérée aux épines vertébrales antérieures et postérieures avec du ciment dentaire. La plaque arrière est équipée de bras d’extension latérales avec des trous de vis qui se fixent rigidement à l’étape du microscope via un bras métallique. Ceci ancre effectivement la vertèbre antérieure et postérieure intacte au stade de microscope, fournissant la résistance mécanique à l’artefact de mouvement qui autrement serait présenté par la respiration et le battement de coeur. La méthode a été optimisée pour la laminectomy d’une seule vertèbre au niveau thoracique 12, omettant les pinces utilisées dans les stratégies alternatives pour la stabilité pendant l’imagerie in vivo. La procédure est rapide, prenant environ 30 min par souris.
Ce protocole peut être utilisé pour étudier les mécanismes de la maladie de la BBB. Le BBB est un système microvasculaire dynamique composé de cellules endothéliales, de muscles lisses vasculaires, de péricytes et de processus astrocytes qui fournissent un environnement très sélectif pour le système nerveux central (SNC). Les données représentatives décrivent l’application de ce protocole chez les souris transgéniques conçues pour exprimer la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP): Claudin-5, une protéine de jonction serrée BBB. Les fichiers d’impression backplate fournis peuvent également être personnalisés pour d’autres applications.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici permet une imagerie stable de la moelle épinière chez la souris à travers une fenêtre en verre. Cette méthode a été appliquée pour évaluer le remodelage de BBB dans les souris transgéniques eGFP:Claudin5/- qui expriment une protéine fluorescente de jonction serrée de BBB, mais elle pourrait être appliquée également bien pour des études de toutes les protéines fluorescentes ou des cellules dans la moelle épinière.
Des méthodes multiples pour la lamin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. Lutz est soutenu par le National Center for Advancing Translational Sciences, les National Institutes of Health, sous Grant KL2TR002002 et les fonds de démarrage de l’Université de l’Illinois Chicago College of Medicine. Simon Alford est soutenu par RO1 MH084874. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des NIH. Les auteurs remercient Dritan Agalliu du département de neurologie du Columbia University Medical Center pour les souris Tg eGFP:Claudin-5, des discussions scientifiques et des idées sur le développement du protocole chirurgical et des applications d’imagerie. Les auteurs remercient Sunil P. Gandhi du Département de neurobiologie et de comportement de l’Université de Californie à Irvine d’avoir conçu le premier prototype de l’appareil stéréotaxique et du contrôleur de température animale, d’avoir discuté du protocole chirurgical et formation à la microscopie à deux photons. Les auteurs remercient également Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) pour son aide dans la personnalisation du stéréomicroscope chirurgical, et Ron Lipinski (Whale Manufacturing) pour l’usinage de pièces stéréotaxiques.
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
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