Avaliação de estresse celular e inflamação em discreta secretoras de ocitocina núcleos de cérebro em ratos Neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de cérebro em cérebro de ratos neonatal, em conjunto com a primeira mamada do colostro. Esta técnica permite o estudo do stress de insuficiência de nutrientes no cérebro como modulada por sinalização do enterócito.

Abstract

O objetivo do presente protocolo é isolar núcleos de cérebro ricas de receptores de ocitocina no cérebro neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro. A expressão de proteínas conhecidas para responder ao estresse metabólico foi medida em cérebro-núcleos isolados usando a mancha ocidental. Isso foi feito para avaliar se induzida por estresse metabólica insuficiência nutriente no corpo provocado estresse neuronal. Demonstramos anteriormente que a insuficiência de nutrientes em recém-nascidos provoca estresse metabólico no intestino. Além disso, a ocitocina colostro modula marcadores de estresse celular autofagia, inflamação e resposta em vilosidades do intestino de rato recém-nascido antes e depois da primeira alimentação. Sinalização de marcadores de proteínas associadas com o estresse de retículo endoplasmático [ER acompanhante imunoglobulina proteína (BiP), 2A de fator de iniciação eucariótico tradução (eIF2a) e quinase da proteína quinase eIF2a R (p-PKR)], bem como dois sinalização de inflamação proteínas [fator nuclear-κB (NF-kB) e inibidor κB (IkB)], foram medidos em núcleos do cérebro recém-nascido [núcleo do trato solitário (NTS), núcleo paraventricular (PVN), núcleo supraóptico (filho), córtex (CX), núcleos striatum (STR), e núcleo preóptica medial (MPO)] antes do primeiro feed (unprimed pelo colostro) e após o início da enfermagem (preparado pelo colostro). Expressão de BiP/GRP78 e p-eIF2a foram upregulated em unprimed e ativador em tecido NTS condicionado. NF-kB foi mantida (alta) no citoplasma CX, STR e MPO, Considerando que o NF-kB foi inferior e inalterado no NTS, PVN e filho em ambas as condições. O BiP coletiva e p-eIF2 achados são consistentes com uma resposta ao estresse. eIf2a foi fosforilada pela quinase dependente do dsRNA (p-PKR) no filho, CX, STR e MPO. No entanto, no NTS (e em menor medida no PVN), eIf2a foi fosforilada pela outra quinase, quinase de controle geral nonderepressible-2 (GCN2). Os mecanismos de estresse-modulando anteriormente observados em enterócitos do intestino recém-nascido parecem ser espelhado em algumas regiões do cérebro ricas OTR. A NTS e PVN podem utilizar um mecanismo de fosforilação diferente (sob deficiência nutricional) de outras regiões e ser refratário ao impacto da insuficiência de nutrientes. Coletivamente, estes dados sugerem que respostas do cérebro ao estresse de insuficiência de nutrientes são compensadas por sinalização de colostro-aprontadas enterócitos.

Introduction

Em contraste com a nossa compreensão do desenvolvimento inicial do cérebro ocorrendo ao longo dos dias-de-semanas pós-parto, relativamente pouco é conhecido sobre a miríade de dinâmicas alterações que ocorrem nas primeiras horas de vida em ratos. Um desafio-chave tem sido o pequeno tamanho do cérebro de ratos neonatal e um requisito para ferramentas de alta tecnologia isolar regiões cerebrais discretas ou células únicas. Estudos frequentemente avaliam gene transcrição e tradução não^1,2, que não dá uma firme compreensão dos níveis funcionais de moléculas sinalizadoras ativados. Outros examinam a expressão usando a imuno-histoquímica para regiões do cérebro de referência, que não permite a quantificação da expressão níveis³. Nenhum estudo até à data, analisou a ativação da sinalização de caminhos associados com colostro primeiro dos ratos, alimentação em regiões distintas do cérebro, que requer rápido isolamento e sacrifício e medição da expressão da proteína e da fosforilação de proteínas usando Western a mancha. Enquanto o cérebro microdissection é executada em cérebros maiores e mais velhos, não identificamos uma referência realizando um soco não-simples-célula cerebral em um cérebro de P0. Este trabalho apresenta um protocolo para isolar regiões restritas do cérebro neonatal usando uma técnica relativamente baixa tecnologia ponche e um Western blotting, com para medir a expressão da proteína em amostras relativamente pequenas. Este protocolo pode ser apropriado para perguntas de pesquisa que exigem a avaliação da expressão da proteína e modificações borne-translational (EG., fosforilação) nas regiões relativamente restritas de cérebros pequenos de qualquer espécie, desde que o usuário pode identificar visualmente a região do cérebro de interesse com um atlas e Marcos identificáveis.

Esta técnica foi desenvolvida para entender as mudanças que ocorrem no cérebro como resultado de colostro primeiro o neonatal dos ratos, alimentação, que é rica em ocitocina (OT). OT tem sido conhecido por sua capacidade de estimular a contração uterina e de descida de leite. No entanto, OT agora é conhecido por tocar uma ampla gama de funções na regulação de muitas funções corporais e comportamentos⁴. Por exemplo, OT se opõe a estresse e inflamação em conjunto com comportamentos de filiação adaptativa⁵, retarda o esvaziamento gástrico e diminui o trânsito intestinal. Receptores de OT (OTR) foram identificados em neurônios entéricos e epitélio intestinal^6,7,8. Os efeitos gastrointestinais do OT são particularmente importantes para a criança durante o período pós-natal. Por exemplo, o aleitamento materno está associado com a entrega de quantidades significativas de OT para o intestino neonatal^9,10, e os dados mostram que o OTR é fortemente overexpressed em vilosidades duodenais durante o leite Leitão período⁸.

Experimentos in vitro usando uma linhagem de células do intestino têm demonstrado a nível celular, a ocitocina modula moléculas importantes na tensão sinalização via^11,12 e desempenha um papel regulador na tradução das proteínas ¹². estes estudos sugerem que componentes do leite, incluindo ocitocina exógena da mãe, são importantes na resposta unfolded da proteína em recém-nascidos para reduzir o estresse celular¹³.

Estudos in vivo e ex vivo demonstraram que o colostro OT modula os marcadores de estresse celular autofagia, inflamação e resposta em vilosidades do intestino de rato recém-nascido. Enterócitos recém-nascido sofrem estresse celular substancial do seu lado luminal quando o intestino é exposto simultaneamente a microbiota da mãe no colostro^14,15 e inúmeras proteínas, inclusive hormônios como OT^{9 , 10 , 16}.

Os efeitos de OT no cérebro foram estudados¹⁷. No entanto, não foram estudados os mecanismos de sinalização OT demonstrados no intestino durante o período pós-natal do cérebro. Neste trabalho, um método para isolar núcleos cerebrais discretas no tronco cerebral neonatal rato e hipotálamo usando electroforese é usado para perfil de regiões isoladas do cérebro. O objectivo geral deste método é capturar o estado de sinalização em áreas do cérebro mais próximo possível ao nascimento, antes e após o primeiro leite Leitão, no tecido do cérebro com o índice mais baixo gliais/neuronal da pilha. A justificativa para o desenvolvimento desta técnica é que ela permite o isolamento rápido de regiões do cérebro microscópico, restrito em neonatais filhotes com uma coleção mais homogênea de neurônios para estudos ex vivo usando uma mancha ocidental automatizado metodologia, oferecendo resultados altamente consistentes em amostras relativamente pequenas dissecados. Uma lacuna de trabalhos anteriores inclui mais bruta dissecção (fatias de cérebro ou todo o cérebro) e mais velhos animais^18,19. Os cérebros dos filhotes são incrivelmente dinâmicos, apresentando ondas de diferenciação glial após o nascimento. Para estudar alterações cerebrais influenciadas pela filhotes da primeira mamada, estudar núcleos neuronais restritos com dissecação reprodutível é necessário.

Alimentação de leite geralmente é analisada pelo seu impacto imunológico e nutricional na saúde ou gene expressão (por exemplo, em enterócitos^20,21), Considerando que seu efeito sobre as áreas do cérebro durante o desenvolvimento do cérebro raramente é estudado. O efeito de trânsito leite no intestino na função cerebral foi analisado em referência ao intestino colecistocinina receptores vagais relé de núcleos do tronco cerebral, mas não a vias de sinalização intracelular²². Há uma vasta literatura sobre a vulnerabilidade do cérebro em desenvolvimento em recém-nascidos, a desnutrição das mães durante a gravidez²³, mas os sinais de estresse e inflamação não são abordados. Importante, o método atual aproveita-se de um fenômeno em recém-nascidos de dia-zero rato que isola os estímulos de sangue-nascido colostro de relé vagal de estímulos viscerais. Este é o período de estresse chamados hipo-responsividade caracterizado por núcleo imaturo tractus solitarius (NTS)-circuito hipotálamo imediatamente após o nascimento^24,,²⁵ que restringe NTS, núcleo paraventricular (PVN), e núcleo supra-óptico (filho) sinaliza a estímulos de sangue-nascido.

Este método é útil para a análise de múltiplas vias de sinalização e relativamente restrito de células neuronais, desde que o tecido cerebral é colhido em dia-0 pós-natal em ratos, além de se as mães têm sido desafiadas ou não por qualquer tipo de tratamento durante a gravidez. Ninhadas podem ser analisadas para os efeitos do colostro versus pré-alimentação sinalização de alimentação. Ao comparar os sinais entre áreas do cérebro com pobres versus rendimento de proteína rica, esse método permite que no capilar determinação de proteína total das bandas polipeptídeo em capilares funcionam a paralelas imune-quantificação de antígenos da proteína. Esse método permite a comparação quantitativa, utilizando unidades arbitrárias, dos resultados obtidos pelo mesmo anticorpo sem curvas padrão quantitativos e por referência a proteína total por capilar. Comparar os resultados obtidos por diferentes anticorpos é possível apenas usando curvas padrão quantitativas.

Este método permitiu a avaliação de bidirecional sinalização ocorrendo entre o intestino e o cérebro e que pode afetar a função em ambos os órgãos,²⁶. A associação entre a ingestão de oxitocina e comida, que tem sido extensivamente estudada em anos recentes²⁷, suporta uma ligação entre a disponibilidade de nutrientes e aumento de ocitocina sinalização. Estes estudos também suportam o conceito de inverso essa energia os défices são acoplados com reduções na sinalização hipotalâmica ocitocina.

Uns estudos mais adiantados do efeito da OT na atividade cerebral demonstraram que inflamação induzida intestino suscitou cFos transcrição no hipotálamo córtex PVN, amígdala e piriform que era refratário a vagotomia²⁸. No entanto, a infusão sistêmica de OT com secretina diminuiu a resposta de cFos do cérebro para a reação inflamatória provocada no intestino²⁸. Isto sugere que o efeito de OT exógena foi realizado por rotas excepto relés vagais, possivelmente através de moléculas sinalizadoras transmitidas pelo sangue, realizadas através da área postrema^6,29.

Neste estudo, as vias de sinalização celular stress que tenham observado anteriormente no intestino foram avaliadas no cérebro. A hipótese era de que componentes do leite podem proteger ou adiar o efeito da inflamação na permeabilidade do intestino para metabólitos microbianos e outros, e por sua vez, os efeitos sobre o funcionamento do cérebro. As diferenças claras antagônicas de IkB contra BiP sinalização encontrada nas vilosidades, antes e depois da escorva pelo colostro¹³, sugeriram que os cérebros de recém-nascidos, ainda no processo de desenvolvimento, podem sentir esses sinais do intestino induzida pelo colostro.

Marcadores de proteína sinalização utilizados em experiências anteriores do intestino que estão associadas com o estresse de retículo endoplasmático foram medidos. Eles incluem o acompanhante ER BiP, eIF2a de fator de iniciação de tradução (que serve como uma resposta de estresse do integrador³⁰), eIF2a quinase p-PKR e duas proteínas de sinalização de inflamação (NF-kB e seu inibidor, IkB).

Foram escolhidas seis regiões do cérebro com base na sua capacidade em adultos secretam ou responder a OT. O NTS, localizado a medula superior, é o primeiro relé da entrada visceral e recebe sinalização direta de neurônios sensoriais vagais no intestino³¹ e possivelmente sangue-nascido citocinas, toxinas e hormônios através da área adjacente-postrema³². O PVN, núcleo supra-óptico (filho), núcleos striatum (STR), córtex cerebral (CX) e núcleo preóptica medial (MPO) recebem sinalização do intestino através da NTS.

Os resultados mostraram que a resposta ao estresse celular durante o período pós-natal imediato antes da escorva de colostro e imediatamente após a primeira mamada é diferente no NTS comparado ao PVN e filho. Sinalização em CX, STR e MPO diferiam do PVN e filho, também. As distintas funções protectoras das OT mostrado anteriormente para modular o estresse celular e inflamação no intestino são provavelmente sentiu por algumas áreas do cérebro. Coletivamente, os dados indicam que a nível celular, durante as primeiras horas após o nascimento, o cérebro responde ao estresse metabólico associado com insuficiência de nutrientes. Os dados também mostram que a extensão e a direção dos efeitos modulando o colostro alimentar dependem da região e que em algumas regiões, espelho efeitos OT mostrados anteriormente no intestino.

Protocol

Este estudo foi aprovado pelo cuidado de Animal institucional e comissões de uso na Universidade de Columbia e o Instituto de Psiquiatria de Nova York estado. 1. tecido preparação Ordem cronometrado de ratos grávidos de fornecedor. Siga cronometrado de ratos grávidos observando seus abdomens crescentes nas semanas após a sua chegada e posteriormente procurando por filhotes na data prevista de entrega inspecionando a gaiola cada 2h até entrega começa. Remov…

Representative Results

As bandas representativas da imunorreatividade em relação à proteína total mostram que existem núcleos de cérebro com muito baixa proteína colhido. Isso requer o uso da técnica automatizada de Western blot, que é altamente sensível em comparação com o borrão ocidental canônico. Esta abordagem pode ser executada com fortyfold menos proteína por capilar em comparação com o por-lane em borrões ocidentais. Efeitos dif…

Discussion

Uma técnica para microdissection Discrete, núcleos de cérebro OTR-ricos em cérebro de ratos neonatal é apresentado neste trabalho. É bem reconhecido que os neurônios são altamente especializados, mesmo dentro de núcleos bem caracterizados no cérebro. Esta abordagem altamente reprodutível para isolar núcleos específicos de OTR ricos permite que o teste de hipótese robusto. Usando a mancha ocidental automatizado, a consistência e a reprodutibilidade dos resultados foram melhoradas. Uma limitação dessa téc…

Materials

Bradford solution	Bio Rad
Protein lysis kit	Protein simple	CBS403	Bicine/CHAPS
WES kits	Protein simple	WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate	Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a	Cell Signaling technology	SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	2103
Rabbit anti-phospho-PKR	Millipore	Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	12297
rabbit mAb anti-GAPDH	Cell Signaling technology	2118
mouse mAb anti-phospho-IKB	Cell Signaling technology	9246
mouse mAb anti-IKB	Cell Signaling technology	4814
rabbit anti-BiP	Cell Signaling technology	3183
Rabbit anti GCN2	Cell Signaling technology	3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2	BIORBYT	T899
pregnant Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories
Punch device	WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core	0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50