Ex Vivo Визуализации ячейки конкретных кальция сигнализации на трехсторонней синапса диафрагмы мыши
Summary
Здесь мы представляем протокол к изображение кальция сигнализации в популяциях типов индивидуальных клеток на перекрестке мышиных нервно.
Abstract
Электрической активности клеток в тканях может контролироваться электрофизиологические методы, но они обычно ограничены к анализу отдельных клеток. Поскольку увеличение внутриклеточного кальция (Ca2 +) в цитозоле часто возникает из-за электрической активности, или в ответ на множество других раздражителей, этот процесс может контролироваться изображений клеток загружен с флуоресцентные кальция чувствительных красители. Однако трудно изображение этот ответ в типе отдельной ячейки в пределах всей ткани, потому что эти красители, принимаются все типы клеток в тканях. Напротив показатели генетически закодированный кальция (GECIs) может быть выражена типа отдельной ячейки и флуоресцировать в ответ на увеличение числа внутриклеточных Ca2 +, позволяя изображений Ca2 + сигнализации в всей популяции типы отдельных клеток. Здесь мы применяем использование GECIs GCaMP3/6 к мыши нервно-Джанкшн, трехсторонний синапса между двигательных нейронов, скелетных мышц и терминал/perisynaptic Шванновские клетки. Мы продемонстрировать полезность этой техники в классическом ex vivo ткани препаратов. С помощью оптического сплиттера, мы выполняем двойной длины волны изображений Ca2 + сигналов динамической и статической метки нервно-Джанкшн (NMJ) в рамках подхода, который может быть легко адаптирована для мониторинга двух клеток конкретных ГЕЧИ или генетически закодированный напряжения показатели (GEVI) одновременно. Наконец мы обсуждаем процедуры, используемые для захвата пространственных карты интенсивности флуоресценции. Вместе эти оптические, трансгенных и аналитические методы могут быть использованы для изучения биологической активности отдельных клеток субпопуляций в NMJ в самых разнообразных контекстах.
Introduction
NMJ, как все синапсы, состоит из трех элементов: Пресинаптический терминал производным от нейрона, постсинаптических нейронов/эффекторных клеток, и perisynaptic глиальных клеток в1,2. Хотя основные аспекты синаптической передачи были впервые представлены на этом синапса3, многие аспекты этого процесса остается неизвестным, отчасти из-за выражение же молекул путем различных клеточных элементов этой синапса. Например рецепторы для пуриновых нуклеотидов аденина СПС и ацетилхолин (АКП), которые совместно выпущенная двигательных нейронов в позвоночных NMJ, выраженные мышцы, Шванновские клетки и двигательных нейронов, что затрудняет интерпретации любого функциональное действие, оказываемое этими веществами (например, передатчик выпуска или ответ, мышечной силы поколения)4. Кроме того хотя трехсторонний компоненты NMJ просты по сравнению с, например, нейронов в центральной нервной системе, которые часто exhibit несколько синаптических входов, ли двигательных нейронов, мышечных клеток или Шванновские клетки изменяться в ответ на стимулы на основе на их внутреннюю неоднородность (например, эмбриональных дифференцирование, волокна подтип, морфология) остается неясным. Для того, чтобы рассмотреть каждый из этих вопросов, было бы целесообразно одновременно отслеживать реакцию многих клеток в пределах одной синаптических элемента, а также трек, в то же время, такой ответ в любом из отдельных элементов. Обычные стратегии, используя химические красители для измерения сигналов кальция не могут достичь этих двух целей, потому что краска ванна прикладной занимает несколько типов клеток после применения к ткани, и внутриклеточно загружен краситель может использоваться только для визуализации отдельных лиц или небольших групп клеток. Здесь, используя трансгенных мышей, выражая GECIs предназначен для измерения кальция клеток конкретных сигнализации, вместе с конкретных изображений и программного обеспечения инструменты5, мы продемонстрировать первый из этих двух общих целей и обсудить как добавление новых Трансгенные инструменты поможет достижению второй. Эта техника будет полезно для тех, кто заинтересован в отслеживания динамики кальция или других сотовых сигнализации наблюдаемых событий через ген закодированы оптических датчиков в несколько клеточных популяций в то же время.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предлагаем некоторые примеры измерения Ca2 + ответы в определенных ячейках нетронутыми нервно-мышечной ткани, с помощью выражения ГЕЧИ мышей. Для того, чтобы успешно выполнить эти эксперименты, крайне важно, чтобы не травмировать диафрагмального нерва во время вскрытия. Ч?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа было поддержано средств от национальных институтов здравоохранения (НИЗ) GM103554 и GM110767 (T.W.G.) и национального центра по 5P20RR018751 научно-исследовательских ресурсов и национального института Генеральной медицинских наук 8P 20 GM103513 (для G.W.H.).
Materials
| Myf5-Cre mice | Jax | #007893 | Drives muscle cell expression as early as E136 |
| Wnt1-Cre mice | Jax | #003829 | Drives expression into all Schwann cells at E13 but not P209 |
| Sox10-Cre mice | Jax | #025807 | Drives Schwann cell expression at older ages |
| Conditional GCaMP3 mice | Jax | #029043 | Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion |
| Conditional GCaMP6f mice | Jax | #024105 | Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion |
| BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) | Hit2Lead | #5102862 | Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6 |
| CF594-α-BTX | Biotium | #00007 | Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ |
| µ-conotoxin GIIIb | Peptides Int'l | #CONO20-01000 | Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8 |
| Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel .9KG | Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins |
| Minutien pins (0.1mm diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel |
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon | MBA74100 | Allows staging and observation of specimen |
| Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator | Autom8 | MXMScr | Allows movement of specimen |
| Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | Holds recording and stimulating electrodes |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording |
| Microelectrode low-noise data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1550 | Allows electrophysiological data acquisition |
| Microelectrode data analysis system | Molecular Devices | PCLAMP 10 Standard | Performs electrophysiological data analysis |
| Square wave stimulator | Grass | S48 | Stimulates nerve to excite muscle |
| Stimulus Isolation Unit | Grass | PSIU6 | Reduces stimulation artifacts |
| Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Impales and records nerve-evoked muscle potentials |
| Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter | Sutter | BF150-117-15 | Lengthened and used for suction electrode |
| Micropipette Puller | Sutter | P-97 | Pulls and prepares recording electrodes |
| 1200×1200 pixel, back-illuminated cMOS camera | Photometrics | Prime 95b | Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging |
| Light Source | Lumencor | Spectra X | Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation |
| Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm | Nikon | CFI60 | Provide long working distances for visualization of specimen |
| Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp | Sumita | LS-DWL-N | Provides illumination for brightfield observation |
| W-View Gemini Image Splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera |
| Single-band Bandpass Filters (512/25-25 and 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Permits dual band imaging |
| 560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter | Sem Rock | FF560-FDi01-25×36 | Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging |
| Imaging data acquisition system | Nikon | NIS Elements – MQS31000 | Allows imaging data acquisition |
| Wavelength control module | Nikon | MQS41220 | Module for imaging data acqusiition |
| Emission splitter hardware module | Nikon | MQS41410 | Module for imaging data acqusiition |
| Imaging data analysis system | NA | Volumetry 8D5, Fiji | Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).
- Fatt, P., Katz, B. An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode. Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).
- Todd, K. J., Robitaille, R. Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction. Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).
- Hennig, G. W., et al. Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon. Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).
- Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology. Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).
- Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).
- Hong, S. J., Chang, C. C. Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse. British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).
- Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue. Elife. 7, e30839 (2018).
- Cho, J. H., et al. The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
