Um túnel de vento para Odor mediada insetos ensaios comportamentais
Summary
Aqui, descrevemos a construção e a utilização de um túnel de vento para odor mediada ensaios comportamentais com insetos. O projeto de túnel de vento facilita a liberação das fontes de odor por vários métodos, com e sem estímulos visuais. Experiências de túnel de vento são métodos importantes para identificar produtos químicos voláteis comportamentalmente ativos.
Abstract
Olfato é o mais importante mecanismo sensorial pelo qual muitos insetos interagirem com seu ambiente e um túnel de vento é uma excelente ferramenta para estudar a ecologia química de insetos. Insetos podem localizar fontes pontuais em um ambiente tridimensional através da interação sensorial e comportamento sofisticado. A quantificação deste comportamento é um elemento-chave no desenvolvimento de novas ferramentas para pragas controle e apoio à decisão. Um túnel de vento com uma seção de voo adequada com fluxo de ar laminar, visual sugestões para feedback durante o voo e uma variedade de opções para o aplicativo de odores pode ser usada para medir o comportamento complexo, que posteriormente pode permitir a identificação do atrativo ou repelente de odores, características de voo do inseto, visual-odor interações e interações entre atrativos e odores remanescentes como os odores de fundo no ambiente. Um túnel de vento possui a vantagem de estudar o odor mediada repertório comportamental de um inseto em um ambiente de laboratório. Medidas comportamentais em um ambiente controlado fornecem a ligação entre a fisiologia de insetos e a aplicação de campo. Um túnel de vento deve ser uma ferramenta flexível e facilmente apoiar as alterações de configuração e hardware para caber as perguntas de pesquisa diferente. A grande desvantagem para o túnel de vento de configuração descrita aqui, é o fundo do odor limpo que exige uma atenção especial ao desenvolver uma mistura volátil sintética para aplicação de campo.
Introduction
O túnel de vento é uma importante ferramenta em estudos de ecologia química de insetos que permitem testes laboratoriais de respostas de insetos de voo de semioquímicos. Pela liberação de odores em um fluxo de vento controlado, resposta comportamental dos insetos a estes estímulos pode ser monitorada diretamente ao estudar seu voo contra o vento em direção a fonte. Olfato é o mais importante mecanismo sensorial pelo qual muitos insetos interagirem com seu meio biótico1. Os insetos usam odor indicações para encontrar parceiros adequados para acasalamento. Da mesma forma, eles usam ramalhetes de odor de recursos de host para encontrar comida para si, ou para a prole. Plantas libertem odores florais em combinação com recompensas néctar e pólen para garantir a eficiência de polinização de insetos. Todos esses sinais voláteis passivamente difundem no ambiente e insetos precisam identificar e interpretar sua relevância individual. Como compostos voláteis são liberados no meio ambiente, as moléculas de viajam com o vento como filamentos, mantendo a concentração inicial para longas distâncias na direção do vento, antes de eventualmente ser separados e diluídos por turbulência e difusão2. Insetos podem detectar alterações minutos a volátil de sinal e direcionar seu movimento contra o vento, em direção a fonte. Insetos exibir um comportamento de voo com surtos rápido contra o vento, quando em contato com um odor atrativo, e moldando para os lados sobre a perda para realocar o odor Caractère3,4. O arranjo co localizado de neurônios olfativos nos sensilas das antenas insetos pode facilitar respostas comportamentais para o início e a perda de contato de pluma com notável alta resolução5 e habilitar os insetos distinguir entre semelhantes moléculas de odor proveniente de diferentes fontes6. Feedback visual ao mesmo tempo em voo, denominado optomotor anemotaxis, é fundamental para identificar a direção do vento, objetos e deslocamento relativo2,7. Pelo uso de interação sensorial e comportamento sofisticado, insetos podem localizar fontes pontuais em um ambiente tridimensional.
A identificação de insetos atrativos e repelentes pode ter vários aspectos importantes de aplicada. Feromonas sexuais (intra-específica sinais) de muitos insetos pragas podem ser sintetizadas e liberadas no ar para perturbar o comportamento acasalamento8. Tanto feromonas e kairomones (sinais interespecíficos) pode ser usado para a captura em massa, atrair e matar no monitoramento de armadilhas para dar informação directa do status de Praga. Repelentes de insetos, como mosquitos9, também podem ser estudados em bioensaios de túnel de vento. Esses métodos desempenham um papel importante de protecção integrada de sistemas de apoio à decisão e gestão para os agricultores.
Bioensaios de túnel de vento, onde o repertório de comportamento mediado o odor de uma espécie pode ser monitorado, é um poderoso método para identificar potenciais novas ferramentas para controle de pragas substituir ou reduzir o impacto da utilização de pesticidas.
O raciocínio teórico por trás do projeto do túnel de vento é completamente descrito10. Aqui, descrevemos a construção do túnel de vento, aplicação de odor e comportamento de voo que foi usado em vários experimentos para determinar o protocolo de bioensaio de túnel de vento. O túnel de vento (Figura 1) em Nibio (Ås, Noruega) é construído a partir de policarbonato transparente resistente a risco. A arena de voo é de 67 cm de altura, 88 cm de largura e 200 cm de comprimento. Na frente da arena de voo, há uma seção adicional do policarbonato, 30 cm de comprimento. Esta parte do túnel de vento serve como uma seção de utilidade para a aplicação de odores. Se os voláteis entrar em contato com o policarbonato habitação na arena de voo, eles podem mais tarde re-lançados e contaminam entre sessões. Em cada extremidade da seção de utilidade, portanto, há uma grade de metal perfurada. As duas grades restringem o fluxo de ar e criar uma ligeira sobrepressão no lado de barlavento. Isso resulta em maior fluxo laminar do lado do vento. Grade de barlavento é feito de uma placa de metal perfurada com furos de 8mm dispersos uniformemente em toda a seção transversal do túnel para fornecer 54% zona aberta. A grade de popa tem furos de 3 mm e um 51% zona aberta. Isto reduz a turbulência e garante que o odor Caractère viagens centralmente todo o comprimento da arena de voo. A pluma de odor terá a forma de um cone estreito e pode ser visualizada pelo uso de fumo. No chão do voo círculos arena, de plástico ou de papel de tamanhos variados (de 5 a 15 cm de diâmetro) são dispostos dar insetos feedback visual durante o voo. Há uma porta de acesso 25 a 50 cm do lado de barlavento da arena de voo e na seção de utilidade. Entre o final de popa da arena de voo e a seção filtro de exaustão, há uma área aberta de 60cm para manipulação de insetos. Esta área de acesso é coberta nas laterais com uma tela de 0,8 mm de malha para impedir que os insetos escapar para o quarto.
Ar é desenhada dentro da primeira caixa de filtro por um fã. O ar que passa através de um filtro de poeira antes de ser purificado por 24 filtros de carvão ativo de alta capacidade e lançado no túnel. O ar sair do túnel é passado através de uma carcaça de filtro semelhante antes de ser lançado de volta para o quarto. Pode ser benéfico para o ar para o exterior do edifício através de um extractor de exaustão. Os fãs em ambas as caixas de filtro são executados com fluxo igual. Tanto os fãs tem um interruptor mais não ofuscante contínuo e são calibrados para diferentes velocidades do vento usando um medidor de vazão. A velocidade do ar é dependente da espécie testada. 30 cm s-1 é, muitas vezes, um bom ponto de partida. Para pequenos insetos, a velocidade do ar ideal pode ser reduzida, e para flyers fortes, a velocidade pode ser maior para aumentar a distância de voo relativo.
O quarto de túnel de vento facilita o controle de temperatura, a umidade e a intensidade da luz. Tiras de LED são colocadas atrás de um painel de poly(methyl methacrylate) opaco de 3 mm para criar uma fonte de luz difusa acima e atrás da arena de voo. Ambas as fontes de luz podem ser controladas de forma independente.
Aplicação do odor pode ser conseguida por vários meios. Geralmente, os odores são liberados para o fluxo de ar no centro da final contra o vento da arena de voo. Dependendo as perguntas de pesquisa na mão, o ponto de lançamento pode ser exposto ou coberto. Um cilindro de vidro (10 cm de diâmetro, 12,5 cm de comprimento) com uma malha de metal (tamanho de engranzamento de 2 × 2 mm) no lado downwind visualmente pode bloquear a fonte do odor e ao mesmo tempo, servir como uma plataforma de pouso para os insetos. Em muitas experiências, uma plataforma de vidro horizontal pode ser usada para apresentar fontes de odor, ou sinais visuais perto do ponto de lançamento. Há também a oportunidade de liberar duas odores ao mesmo tempo, lado a lado, para facilitar a escolha de ensaios. Os pontos de lançamento são então colocados 20 cm afastados e as plumas de odor sobrepõem-se a meio do caminho pelo túnel. A escolha então pode ser identificada pelo qual pluma o inseto está seguindo contra o vento.
O projeto de túnel de vento facilita numerosos métodos de liberação de voláteis. Por exemplo, um odor específico pode ser lançado na frente de um odor de fundo como emitido por uma planta de colheita11,12. Além disso, diferentes estímulos visuais podem ser testado13,14. A instalação experimental deve ser adaptada a cada pergunta de pesquisa e espécies.
Fontes de odor natural, como as partes da planta e odores sintéticos de distribuidores podem ser introduzidas diretamente para a arena de voo. Para isolar o odor mediada por comportamentos de visual, a fonte do odor pode ser coberta, ou os compostos voláteis levou para a arena de voo através de um suprimento de ar de carvão laboratório filtrada do lado de fora. A fonte de odor confina-se então a uma jarra de vidro e o ar é empurrado através do frasco para dentro do túnel de vento através de tubos de vidro e tubos de Teflon. A velocidade do ar no ponto de liberação deve coincidir com a velocidade do vento na arena.
Para liberar odores em proporções de mistura específica, um pulverizador pode ser usado. O pulverizador é um bocal ultra-sônico com uma ponta cónica e do furo micrométrico inserido para facilitar um fluxo líquido em 10 µ l min-1. O bocal é conectado a um gerador de ultra-som em banda larga e opera em 120 kHz. Uma bomba de seringa está empurrando a amostra de odor para o bocal de pulverizador. Fluorados etileno propileno (FEP) um tubo com diâmetro interno de 0.12 mm é conectar a seringa gastight 1ml e o bocal. Adaptadores de tubos que incham em etanol e encolhem no ar, facilitar apertadas montagem com nenhum volume interno. O tamanho de gotículas de aerossol gerado a partir da vibração do bocal é dependente de frequência e depende do solvente específico usado. As pequenas gotas evaporam e são trazidas para o túnel de vento como compostos voláteis. Outros projetos de pulverizador também existem, e uma versão mais barata, utilizando um piezo conduzido vidro capilar fornece uma solução semelhante15.
Misturas sintéticas ou coleções de headspace podem ser usadas com o pulverizador. As amostras são diluídas com álcool puro para as concentrações desejadas. Com coleções volátil, a amostra pode ser diluída para corresponder ao tempo a coleção. Isto significa que uma coleção voláteis amostrada mais 3 h deve ser diluída a 1800 µ l, que, em um comunicado, taxa de pulverizador em 10 µ l min-1 corresponde a 3h.
A identificação do comportamento de voo pode ser feita diretamente pela observação manual ou por análise post-hoc de vídeo. O voo orientado deve ser distinguido do voo aleatório. Odor mediada comportamento pode ser reconhecido pelas seguintes características: voo de zig-zag através do odor plume, voo direto contra o vento quando dentro da pluma, e loop de volta se o contato com a pluma é perdido. Após a perda de uma pluma atraente, os insetos também podem começar a zig-zag com crescente arcos para reconectar-se com a pluma perdido3,4. Este comportamento é fundamental em um cenário de campo onde os insetos seguindo um odor atrativo precisam lidar com a turbulência e mudando as direções de vento. O padrão de voo não é uniforme e varia consoante as ordens de insetos. Por exemplo, folhetos fortes como varejeiras têm uma orientação mais rápida contra o vento com maior padrão de fundição que traça, e a velocidade do vento deve ser aumentada para facilitar um caminho relativo do voo mais longo.
O voo de um inseto também pode ser filmado. Com uma única câmera, características de voo simples podem ser descritas por plotagem de coordenadas de y a x16. Usando duas câmeras com captura de quadro sincronizado, o voo 3D pode ser reconstruído usando um software externo17. A pista de voo pode ser analisada para dar informações sobre a velocidade de voo e distância, os ângulos de voo com relação a direção do vento e os detalhes sobre as características de voo em relação a pluma de odor. Há equipamentos personalizados e comerciais e softwares disponíveis que permitem o rastreamento automático de quadro a quadro. Os quadros de calibração devem ser usados para referenciar o espaço de mundo real, e retilíneas lentes grande angular devem ser usadas para minimizar a distorção da lente. Cuidado deve ser tomado para reduzir o ruído de fundo visual, tais como bordas e cantos na arena de túnel de vento e maximizar o inseto de discriminação de fundo. Usando uma fonte de luz infravermelha, a reflexão (ex., dos mosquitos noturnos) pode ser filmado com monocromático de câmeras CCD17.
Protocol
Representative Results
Discussion
O túnel de vento é uma ferramenta útil para a identificação de odores atraentes e repelentes para muitos insetos4,9. Com sólidos conhecimentos da ecologia, biologia e comportamento do inseto estudado, suas características de voo podem ser facilmente identificadas e as condições ambientais, velocidade do vento, estímulos visuais e aplicação de odor podem ser adaptados para caber. É recomendável quando começando com uma nova espécie, para ajustar os…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M. Tasin foi apoiada pelo Conselho de pesquisa sueca para o desenvolvimento sustentável (Formas, Grant 2013-934).
Materials
| Flight arena | any | NA | Construct to fit the filter housing |
| Filter housing x 2 | Camfill Farr | Contains the dust and charcoal filters | |
| Fan x 2 | Fischbach | Model D640/E35 | Silent fan with continous dimmer switch |
| Perforated grids | any | NA | Two different open areas are needed, e.g. 54 and 51% |
| Flowmeter | Swema air | Swema air 300 | Identifying the wind speed |
| Ultrasonic sprayer | SonoTek | Sprayer nozzle with conical tip and inserted microbore | |
| Broadband ultrasonic generator | SonoTek | Function generator | |
| Syringe pump | CMA microdialysis | CMA 102 | Liquid delivery |
| FEP tubing | CMA microdialysis | 0.12 mm inner diameter | |
| Tubing adaptors | CMA microdialysis | Connectors for zero internal volume | |
| Gastight syringe | any | NA | 1000 µL syringe for headspace collections and synthetic blends |
| Gastight syringe | any | NA | 1000 µL syringe for cleaning sprayer |
| Torch | any | NA | Small light source for checking sprayer release |
| Timer | any | NA | Timer with alarm function |
| Holder for insect release | any | NA | Metal construction |
| Lighting | any | NA | LED is preferable due to low heat production |
| Moisturiser | any | NA | Size depends on volume of wind tunnel room |
| Temperature control | any | NA | Temperture range depends on species |
| Glass tubes | any | NA | Tubes (2.8 cm diameter, 13 cm long) for insects |
| Snap cap | any | NA | Snap cap that fits the glass tube |
| Gauze | any | NA | Fabric to close the glass tube |
| Rubber band | any | NA | To hold gauze in place |
| Glass cylinder | any | NA | Cylinder for odour containment and landing platform (10 cm diameter, 12.5 cm long) |
| Glass jars | any | NA | Glass jars for dynamic headspace collection |
| Connectors and tubes | any | NA | Tubes and connectors depends on type of glass jars |
| Air supply | any | NA | From laboratory air or bottles |
| Charcoal filters | any | NA | For cleaning the outside air sypply |
| Vial | any | NA | Small vial with water to keep plant material fresh |
| Oven | any | NA | Heat metal and glassware to 300 degrees to decontaminate |
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