Automated panneau Multiplex Immunofluorescence pour des études sur des échantillons de tissus fixés au formol carcinome Immuno-oncologie
Summary
Un protocole détaillé pour un panel de six-marqueur immunofluorescence multiplex est optimisé et réalisé, en utilisant une passoire automatisé pour des résultats plus uniformes et une courte procédure. Cette approche peut être directement adaptée par tout laboratoire d’études immuno-oncologie.
Abstract
L’évolution continue en immuno-oncologie nécessite une compréhension accrue des mécanismes de l’immunologie du cancer. L’analyse d’immunoprofiling des échantillons de tissus de biopsies (FFIP) fixés au formol, paraffine est devenu un outil essentiel pour comprendre la complexité de l’immunologie des tumeurs et la découverte de nouveaux biomarqueurs prédictifs pour l’immunothérapie contre le cancer. Immunoprofiling analyse des tissus nécessite l’évaluation de marqueurs combinés, y compris les sous-populations de cellules inflammatoires et immunitaires points de contrôle, dans le microenvironnement tumoral. L’avènement des méthodes immunohistochimiques multiplex roman permet une analyse multiparamétrique plus efficace des sections de tissu unique que ne monoplex standard immunohistochimie (IHC). Une immunofluorescence multiplex disponible dans le commerce (si) méthode est basée sur l’amplification du signal-tyramide et, combinée à une analyse microscopique multispectrale, permet une meilleure séparation du signal de divers marqueurs dans les tissus. Cette méthode est compatible avec l’utilisation de l’anticorps primaires qui ont été optimisés pour IHC standard sur des échantillons de tissu FFPE. Ici nous décrivons en détail un protocole automatisé qui permet multiplex si l’étiquetage des échantillons de tissus de carcinome avec un panel de six-marqueur anticorps multiplex comprenant PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 et AE1/AE3 cytokératines au 4′, 6-diamidino-2-phénylindole comme contre-colorant cellule nucléaire. Le protocole de panneau multiplex est optimisé dans une passoire IHC automatisé pour un temps de coloration qui est plus courte que celle du protocole manuel et peut être directement appliqué et adapté par n’importe quel enquêteur de laboratoire pour les études sur des échantillons de tissu FFPE humains immuno-oncologie. Également décrites sont plusieurs commandes et outils, notamment une méthode de la goutte-contrôle pour contrôle de la qualité fine d’un nouveau panneau multiplex de IF, qui sont utiles pour l’optimisation et la validation de la technique.
Introduction
Immunoprofiling analyse des échantillons de tissu de tumeur FFPE est devenue une composante essentielle des études immuno-oncologie, en particulier pour la découverte et la validation de nouveaux biomarqueurs prédictifs pour l’immunothérapie contre le cancer dans le cadre d’essais cliniques1 ,2. Épreuve à développement chromogène IHC, aide chimiques chromogènes tels que diaminobenzidine, reste la technique standard en pathologie diagnostique pour l’immunomarquage de biopsie tissulaire3. IHC standard peut également être utilisé pour le cancer des tissus immunoprofiling, y compris la quantification des sous-populations de lymphocytes associées à la tumeur et l’évaluation des niveaux d’expression de points de contrôle immunitaires comme ligand de mort cellulaire programmée 1 (PD-L1)4 ,,5. IHC standard est limitée, cependant, en ce que qu’un seul antigène peut être étiqueté par section de tissu. Parce que les études d’immunoprofiling exigent généralement l’analyse de l’expression combinée de plusieurs marqueurs, l’utilisation de l’IHC standard nécessiterait la coloration des coupes de tissus multiples, chacun colorées avec un seul marqueur et, par conséquent, serait considérablement limité pour l’analyse des échantillons de tissus petit comme les biopsies à l’aiguille centrale. Méthodes IHC standard sont aussi limitées pour l’évaluation des marqueurs qui sont co-exprimés par les populations de diverses cellules, comme c’est souvent avec des marqueurs de point de contrôle immunitaire tels que PD-L1, qui s’exprime par les macrophages associées à la tumeur et les cellules cancéreuses. Cette limitation a été signalée dans, par exemple, l’utilisation du standard monoplex IHC de pathologistes pour l’analyse quantitative d’un marqueur d’IHC exprimée par diverses cellules types6. Le développement de multiplex chromogène IHC techniques employant divers chromogènes colorées sur le même tissu section représente un développement ultérieur au cours de la méthode standard de monoplex IHC,7 bien qu’ils restent limités par l’immunomarquage de peu marqueurs et présentent également un défi technique important pour une évaluation appropriée des marqueurs exprimés dans les compartiments subcellulaires mêmes des mêmes populations cellulaires.
Les mises en garde susmentionnées concernant la disponibilité de tissus d’échantillons cliniques, ainsi que les limites des techniques IHC chromogène multiplexes, ont donné lieu à la nécessité d’élaborer des méthodes améliorées de multiplexes pour les études immuno-oncologie basées sur marquage fluorescent combinée avec les systèmes qui peuvent effectivement séparer les signaux des fluorophores multiples de la même lame d’imagerie. Une telle technique est basée sur l’amplification de signal de tyramide (TSA) combinée avec l’imagerie multispectrale microscopie pour couleur efficace séparation8. Un kit disponible dans le commerce axée sur les TSA emploie fluorophores optimisés pour imagerie multispectrale8 (voir la Table des matières). Un avantage essentiel de ce système est sa compatibilité avec les mêmes anticorps primaires non étiquetés qui ont déjà été validés et optimisé pour la norme chromogène IHC9,10,11. Cela permet non seulement une optimisation plus rapide, mais aussi souplesse dans les modifications d’optimisation et panneau incorporant de nouvelles cibles. En outre, la méthode TSA multiplex immunofluorescence (mIF) peut être optimisée pour commercialement disponible IHC stainer des systèmes automatisés, afin de permettre un transfert simple de monoplex IHC chromogène au mIF.
Nous présentons ici un protocole pour un tableau de mIF pour les études immuno-oncologie basée sur automatisé mIF TSA coloration et utilise un scanner multispectral pour l’imagerie. Ce protocole peut être adapté et modifié par n’importe quel utilisateur de laboratoire ayant accès à des instruments décrits et les réactifs. Le protocole inclut un panel de six anticorps primaires pour l’immunoprofiling des carcinomes : PD-L1, PD-1, CD68 (comme un marqueur de pan-macrophage), CD8 (cellules T cytotoxiques), Ki-67 et AE1/AE3 (pan-cytokératine, utilisé comme un marqueur épithélial pour l’identification des cellules de carcinome). Une étude récente décrit l’optimisation d’un protocole de mIF TSA manuelle en utilisant IHC chromogène comme un standard de référence pour valider le multiplex12de coloration. La méthode de mise à jour présentée ici a été développée en utilisant un kit TSA commercialement disponible, sept couleurs optimisé dans une passoire automatisé, raccourcir considérablement le temps de coloration de 3 à 5 jours à 14 h, tout en améliorant la cohérence de la coloration. Outre le protocole principal détaillé présenté ici, une section de Matériaux supplémentaires comprend la méthode « goutte-control », un processus de contrôle de qualité supplémentaire pour évaluer un nouveau panneau de mIF, ainsi que des notes techniques pour l’optimisation, dépannage et le développement de nouveaux panneaux multiplex pour aider l’utilisateur de laboratoire mis en place et optimiser le procédé TSA mIF de mIF personnalisés panneaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
La révolution de l’immunothérapie du cancer en cours est ouverture roman et en promettant des options thérapeutiques pour les patients de cancer13. Avancées dans le domaine de l’immuno-oncologie nécessitera une connaissance accrue du microenvironnement tumeur inflammatoire, non seulement pour comprendre la biologie des mécanismes immunologiques impliqués dans la carcinogenèse mais aussi pour trouver des biomarqueurs prédictifs pour neuf traitements immunothérapie1</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aide à la rédaction a été fourni par Deborah Shuman de MedImmune.
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
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