Cet article décrit un nouveau modèle de traumatisme crânien de blast primaire. Un tube de choc conduit d’air comprimé est utilisé pour exposer en vitro cultures tranche hippocampe de souris à une seule onde de choc. Il s’agit d’un protocole simple et rapid, générant une lésion tissulaire de cerveau reproductible avec un débit élevé.
Traumatisme crânien est des principales causes de décès et d’invalidité chez les populations civiles et militaires. Blast traumatisme cérébral blessures résultats depuis l’explosion d’engins explosifs, cependant, les mécanismes qui sous-tendent les lésions cérébrales résultant de l’exposition de surpression de souffle ne sont pas entièrement comprises et sont considérés comme propres à ce type de lésion cérébrale. Les modèles précliniques sont des outils essentiels qui contribuent à mieux comprendre les lésions cérébrales induite par l’explosion. Un modèle TBI roman in vitro blast a été développé en utilisant un tube de choc à composition non limitée pour simuler des vagues de vie réelle explosion de plein champ modélisées par l’onde de Friedlander. Hippocampe organotypiques souris C57BL/6N ont été exposés à des ondes de choc unique et le développement des lésions a été caractérisé jusqu’à 72 h à l’aide d’un marqueur fluorescent bien établi des lésions cellulaires que seul, l’iodure de propidium pénètre les cellules avec compromis les membranes cellulaires. Fluorescence de l’iodure de Propidium a été significativement plus élevé dans les secteurs exposés à une onde de choc par rapport aux tranches d’imposture pendant toute la durée du protocole. Les lésions du cerveau sont très reproductible et proportionnelle à la surpression de la crête de l’onde de choc appliquée.
Lésion cérébrale traumatique de Blast (TBI) est un type complexe de lésions cérébrales résultant de l’explosion d’engins explosifs1,2. Blast TBI est devenue un important problème de santé au cours des 15 dernières années, avec les récents conflits militaires en Irak et en Afghanistan,2,3. Globalement, on estime qu’entre 4,4 % et de 22,8 % des soldats de retour d’Irak et d’Afghanistan ont souffert des TBI doux, une grande partie d’entre elles étant liées au souffle, avec un taux plus élevé rapporté de blast TBI dans les forces américaines contre les forces du Royaume-Uni4 ,,5.
L’utilisation d’engins explosifs a été responsable de la majeure partie du traumatisme lié à l’explosion, y compris blast TBI, endurée par les forces militaires6. La détonation d’une charge explosive se traduit par une très rapide — mais transitoire — augmentation de la pression, se produisant en millisecondes. L’onde de surpression résultant d’une explosion de champ libre de la vie réelle est modélisée par la fonction de Friedlander, avec une hausse soudaine de la surpression maximum suivie d’une décroissance exponentielle7,8. La gamme des forces extrêmes et leur évolution rapide vu lors d’une manifestation de l’explosion ne sont pas généralement expérimentés en traumatismes non-blast1,9. La surpression de pointe, c’est-à-dire la pression maximale de l’onde et la durée de l’onde positive sont soupçonnés d’être des contributeurs importants à une lésion cérébrale blast et ceux-ci dépendent de la charge explosive et la distance de la détonation de10, 11.
Le traumatisme que les résultats d’une explosion explosive est classé comme quatre composants discrets, désignés comme l’explosion primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire des blessures10,12,13,14. Chacune de ces composantes est liée à des mécanismes spécifiques de blessure. Blast primaire préjudice est le résultat de l’action directe de l’onde de surpression sur les organes et tissus2,13. Résultats de blessure explosion secondaire de l’impact des fragments de projectiles, provoquant pénétrante et non pénétrantes plaies2,15. Blast tertiaire lésions se produisent lorsque le corps de la victime est déplacé contre le sol ou les objets environnants et est associé à l’accélération/décélération forces1,10,13. Blessure de blast quaternaire décrit un groupe hétérogène de blessures directement liées à l’explosion ne relevant ne pas de la première trois blessure mécanismes décrits12,13. Il inclut (mais n’est pas limité à) lésion thermique, inhalation de fumée, rayonnement, ondes électromagnétiques et des effets psychologiques négatifs13,15. La plupart TBI associée à explosion résulte directement des trois premiers mécanismes de blessures, tandis que les mécanismes du quaternaire des blessures de blast sont généralement associés aux lésions systémiques13. Les effets des forces d’accélération/décélération (p. ex., coup du lapin), émousser et pénétrant de traumatisme crânien ont été intensivement étudiés par rapport à d’autres types de TBI (p. ex., collisions de véhicules automobiles, chutes, blessures balistique). Toutefois, l’onde de surpression de choc primaire est unique à l’injure de l’explosion et ses effets sur les tissus cérébraux sont beaucoup moins bien compris16. Les mécanismes de blessure explosion primaire, associées à une onde de surpression, sont les premiers des forces mécaniques pour interagir avec le cerveau.
Nombreux modèles précliniques de TBI ont été développés durant les dernières décennies qui ont été très précieux pour comprendre les mécanismes TBI souffle de blessures et de physiopathologie et étudier de nouveaux traitements potentiels, qui seraient autrement impossibles à faire exclusivement dans les cliniques définissant le17,18,19. Bien qu’aucun modèle préclinique ne peut reproduire la complexité des traumatismes crâniens blast clinique, généralement différents modèles précliniques de TBI répliquent des aspects distincts de TBI humaine. L’action nuisible des forces associées à une explosion de souffle peut être étudiée isolément ou en combinaison dans les modèles TBI blast fois in vitro et in vivo . In vitro les modèles ont l’avantage de permettre un contrôle strict de l’environnement expérimental (tissu conditions physiologique et biomécanique de la blessure), qui réduit la variabilité biologique et améliore la reproductibilité, permettant l’étude des moléculaires spécifiques des cascades sans les variables confusionnelles présentes dans les animaux modèles20. Notre objectif était de développer un modèle in vitro afin d’étudier les effets d’explosion primaire sur le tissu cérébral. L’étude visait à élaborer un modèle avec une onde de choc supersonique avec un représentant de forme d’onde de Friedlander d’une explosion de champ libre tel que celui produit par un engin explosif improvisé (IED).
Parmi tous les mécanismes des lésions associées à explosion TBI (mécanismes de blessure explosion primaire, secondaire et tertiaire), principal blessures blast sont unique à un traumatisme de l’explosion et c’est le moins compris des mécanismes associés à blast1,2 . Le nouveau protocole décrit ici a été développé pour étudier l’explosion primaire TBI en utilisant un tube de choc à composition non limitée pour exposer en vitro cultures tranche hippocampe de souris à une seule onde de choc à l’aide d’un protocole simple et rapid qui permet la création d’un reproductible blast primaire TBI avec un débit élevé.
La première en vitro explosion primaire TBI modèles appliqués ondes de pression hydrostatique à cellules26,27. Toutefois, la sortie de pression modèle pas la fonction de Friedlander comme la durée d’une impulsion de pression hydrostatique était beaucoup plus longue que blast aéroporté surpression vagues13. La caractéristique Friedlander fonction peut être facilement modélisée en laboratoire au moyen d’un choc tube1,8. Le tube de choc peut produire des ondes de choc qui simulent des explosions de terrain dégagé de réelles dans un environnement de laboratoire classiques, tout en permettant un contrôle précis des paramètres de l’onde, comme surpression maximale, la durée de l’onde positive et impulsion, en faisant varier la matériau et épaisseur et le pilote volume8,28,29.
Simple in vitro des modèles tels que les cultures de cellules manquent habituellement de l’hétérogénéité des types de cellules et la connectivité synaptique30. Récemment, l’effet de souffle sur cellule du cerveau in vitro « sphéroïdes » intégrant les différents types de cellules a été étudié31. Une enquête plus poussée de ces préparations intéressantes est justifiée ; Cependant, il n’est pas clair comment leur organisation cellulaire et la connectivité reflète le cerveau intact. CSST sont un bien établie in vitro modèle expérimental23,32, sont faciles à la culture et de leur tissu tridimensionnel cytoarchitecture, la différenciation cellulaire et la connectivité synaptique sont bien conservées et très semblable à celui en vivo33,34,35,36. OHSCs représentent un niveau intermédiaire de complexité entre culture cellulaire et une en vivo modèle23,32. OHSCs ont été démontrées à reproduire in vitro neurodégénératives pathologique cascades vus dans des modèles in vivo et ont été très utiles au contrôle des médicaments neuroprotecteurs potentiels et dans la compréhension de leurs mécanismes de action17,21,22,37,38. Enfin, la zone anatomique étudiée, l’hippocampe, est très pertinente dans les études translationnelles de TBI, car cette région est souvent endommagée dans TBI patients39,40,41. CSST ont servi à blast modèle TBI28,42,43,44, toutefois, notre modèle est relativement simple et peut être adaptée aux chocs-tubes existants soit horizontal ou vertical configurations sans adaptations complexes.
CSST peut être maintenue en culture pendant plusieurs jours, qui facilite l’étude des processus biologiques au fil du temps,34. Dans ce modèle, les lésions résultant de l’exposition de l’onde de choc a été mesurée par jour pendant trois jours, suite à l’exposition de souffle à l’aide de l’iodure de propidium, un marqueur bien établi des dommages cellulaires. L’iodure de Propidium est un colorant fortement polaire non toxique qui pénètre dans les cellules avec les membranes cellulaires compromis, où il se lie aux acides nucléiques et présente une fluorescence rouge vif caractéristique24,25,45. La fluorescence mesurée avec l’iodure de propidium a démontré avoir une bonne corrélation avec la numération lésé à l’aide de Nissl coloration46,47.
Étant donné que la blessure produite dans ce modèle était diffus (Figure 2), la fluorescence de la tranche entière a été mesurée lors de l’exécution de l’analyse, similaire aux travaux déjà publié dans autres cerveau lésions paradigmes21,22 , au lieu d’utiliser des régions spécifiques, comme l’a fait l’autre en vitro blast TBI modèles28,43,44,48. L’approche globale utilisée dans le modèle décrit dans cet article élimine également la variabilité qui est introduite lorsque décrivant régions d’intérêt définies et fournit une image plus complète de la lésion liée au souffle. Les surpressions pic onde de choc, 50 kPa et 55 kPa, produit significatif (p < 0,05 et p < 0,0001, respectivement) blessures par rapport aux tranches de sham (Figure 2B). Comme prévu, l’onde de choc avec la surpression maximale plus élevée, 55 kPa, a causé des lésions plus que la vague de 50 kPa. Un modèle in vitro avec cerveau isolé tissu exposé directement à une onde de choc, comment avec précision à l’échelle de l’organisme entier ou un être humain n’est pas simple. Néanmoins, nous avons utilisé de l’onde de choc s’est dans l’intervalle des surpressions pic observé sur le terrain, généralement 50 – 1 000 kPa8,49.
Afin de maintenir le CSST exposé à des niveaux d’oxygène et de dioxyde de carbone et température physiologique tout en s’assurant qu’ils sont exempts de contamination dans tout le protocole d’exposition onde de choc, les inserts de culture de tissu ont été scellées dans stérile sacs de polyéthylène suivant une technique aseptique, immergée dans un milieu expérimental chauffé à 37 ° C et fraîchement barboter avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone, de même aux travaux déjà publiés28,43,44 ,48. Contrairement à ces modèles où les dispositifs complexes étaient utilisées pour conserver les sacs stériles pendant l’exposition de l’onde de choc, dans ce protocole, une méthode rapide et simple a été utilisée pour suspendre les inserts de culture cellulaire CSST en face de la sortie de tube de choc (Figure 1 a, C ). Le modèle décrit dans le présent document permet un traitement rapide et un débit élevé, tout en minimisant le risque d’hypothermie. Ces aspects sont particulièrement pertinents pour les études de neuroprotection étant donné que certaines interventions thérapeutiques peuvent avoir une fenêtre de temps très limité du potentiel d’application après le TBI. Ce protocole d’exposition nouvelle onde de choc permet de 6 à 9 vitroplants insère (généralement de 36 à 54 organotypique hippocampe tranches de tissus) pour être exposé à une onde de choc dans un court intervalle de temps (environ 1 h).
Les OHSCs besoin bonne asepsie tout au long. Il est important d’utiliser une hotte à flux laminaire aseptique tout au long de la mise en culture et lors du transfert vers les sacs stériles pour l’explosion. Afin de réaliser l’imagerie tranche dans des conditions aseptiques avec les couvercles des plaques 6 puits en place, les anneaux en métal sur mesure nous permet de soulever les inserts de culture cellulaire pour le plan focal du microscope. Une partie importante de notre protocole, c’est que nous incluons des tranches de sham indemne dans chaque expérience. Tranches de trompe-l’œil sont traités identiquement aux tranches de souffle à l’exception que le tube de choc n’est pas déclenché ; une autre étape importante est que toutes les tranches sont imagés 1 h avant l’accident ou traitement simulé, pour s’assurer que la santé de la population de tranches utilisées sont identiques (Figure 2 b).
En plus de la quantification des lésions des cellules dans les tranches au fil du temps, le tissu peut être fixé à la fin de l’expérience pour immunohistochemistry classiques50. Nous avons développé et évalué la méthode à l’aide de tranches d’hippocampe de souris. Cependant, notre technique pourrait être facilement adapté à utiliser d’autres tissus que l’on peut cultiver dans la culture, tels que la moelle épinière, rétine, pulmonaire ou tissu épithélial. Dans cet article et nos travaux antérieurs avec le modèle, nous avons ne étudié que l’effet de l’exposition à une seule émission. Toutefois, le modèle serait bien adapté pour étudier les effets d’explosions répétées de bas niveau sur le cerveau ou d’autres tissus. OHSCs peuvent être maintenues en culture pendant plusieurs semaines voire des mois, ce qui permet des effets chroniques, être l’objet d’une enquête.
Modèles in vitro , étant plus simples que les modèles in vivo , ont un débit plus élevé, sont moins coûteux et expériences peuvent habituellement être complétées sur une échelle de temps plus court17. Toutefois, les résultats obtenus à l’aide des modèles in vitro doivent être validées dans des modèles animaux in vitro culture de tissus sont conservés dans un environnement artificiel et peuvent répondre à l’injure différemment de ce qu’ils le feraient en vivo17. Néanmoins, des modèles in vitro ont été extrêmement précieuses pour améliorer notre compréhension du cerveau cascades de blessures et en dépistage de médicaments neuroprotecteurs avant l’utilisation des plus complexes en vivo modèles17,22 , 51 , 52. malgré les nombreux avantages offerts par ce modèle, il est important de noter que les modèles in vitro n’ont pas la clé caractéristiques du TBI présent chez les animaux et en vivo modèles, tels que les effets sur le système vasculaire, augmenté intracrânienne pression, réponse immunitaire systémique et atteinte fonctionnelle comportementale, qui met en évidence la nécessité de valider les résultats dans des modèles in vitro chez l’animal entier. Néanmoins, en vitro modèles tels que le modèle décrit dans cet article sont extrêmement utiles outils scientifiques pertinents translationnelle.
En conclusion, cet ouvrage décrit une nouvelle méthode simple et directe, où les cultures de tissus hippocampiques souris organotypique sont exposés à étroitement contrôlés et reproductibles réelles pertinentes des ondes de choc à l’aide d’un tube de choc de laboratoire. Le préjudice global, qui a été quantifié à l’aide de l’iodure de propidium, un marqueur bien établi des dommages cellulaires, est très reproductible et est proportionnel à la surpression de la crête de l’onde de choc appliquée.
The authors have nothing to disclose.
Soutenu par : Centre Royal de médecine de la défense, Birmingham, Royaume-Uni, Royal British Legion Centre for Blast blessure études, Imperial College London, United Kingdom. Medical Research Council, London, United Kingdom (MC_PC_13064 ; MR/N027736/1). La sécurité gaz Trust, Londres, Royaume-Uni. Rita Campos-Pires a été le récipiendaire d’une bourse de formation doctorale de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia, Lisbonne, Portugal. Katie Harris a reçu une bourse de doctorat de la Westminster Medical School Research Trust, Londres, Royaume-Uni.
Ce modèle a été développé avec le soutien de la Royal British Legion Centre pour les études de blessure Blast (RBLCBIS) à l’Imperial College. Nous tenons à souligner l’appui financier de la Royal British Legion. Chercheurs intéressés de collaborations ou de plus amples renseignements peuvent communiquer avec les auteurs ou les RBLCBIS.
Nous remercions Dr Amarjit Samra, directeur de recherche du Centre Royal de défense médecine, Birmingham, Royaume-Uni, pour soutenir ce travail, Scott Armstrong, département de chirurgie et Cancer, Imperial College London, assistance avec des expériences préliminaires , Theofano Eftaxiopolou, Hari Arora & Luz Ngoc Nguyen, département de génie biologique Imperial College London, William Proud, département de physique Imperial College de Londres, pour obtenir des conseils sur le tube de choc, Raquel Yustos, technicien, ministère de la recherche des Sciences de la vie, Imperial College London, responsable support technique, Paul Brown MBE, atelier et Steve Nelson, technicien d’atelier, département de physique de l’Imperial College de Londres, pour rendre le métal anneaux, Neal Powell du département de physique, Imperial College London, de œuvres d’art.
Geys balanced salt solution | Sigma UK | G9779 | |
D- glucose | Sigma UK | G8270 | |
Antibiotic/antimycotic | Sigma UK | A5955 | |
Minimum essential medium Eagle | Sigma UK | M4655 | |
Hanks balanced salt solution | Sigma UK | H9269 | |
Horse serum | Sigma UK | H1138 | |
L-glutamine | Sigma UK | G7513 | |
HEPES | VWR Prolabo, Belgium | 441476L | |
Sodium hydroxide | Sigma UK | S-0945 | |
Tissue culture inserts | Millicell CM 30 mm low height Millipore | PICM ORG 50 | |
6-well plates | NUNC, Denmark | 140675 | |
Propidium iodide | Sigma UK | P4864 | |
Sterile polyethylene bags – Twirl'em sterile sample bags | Fisherbrand | 01-002-30 | |
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127mm) | Smiths Medical Supplies | E910 | |
Epifluorescence microscope | NIKON Eclipse 80i, UK | ||
Microscope objective | Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm | ||
Microscope filter | Nikon G-2B (longpass emission) | ||
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components UK | 785-0782 | |
Pressure transducer | Dytran Instruments Inc. | 2300V1 | |
Tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. | Mcllwain tissue chopper | |
Silicone elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 | |
Graphing & statistics software | GraphPad Software, USA | Prism 7.0 |