Оценка метаболических профиля первичных лейкозных клеток
Summary
Здесь мы представляем протокол для изоляции лейкозных клеток из костного мозга пациентов лейкемии и анализ состояния их метаболизма. Оценка метаболических профиля первичных лейкозных клеток может помочь лучше охарактеризовать требование начальной клеток и может способствовать более персонализированной медицины.
Abstract
Метаболические требования раковых клеток может негативно повлиять на выживание и эффективности лечения. В настоящее время фармацевтических ориентации метаболических испытания во многих типах опухолей. Таким образом характеристика раковых клеток метаболические установки является неизбежным для правильный путь для улучшения общего итога пациентов. К сожалению в большинстве случаев рака, злокачественные клетки являются довольно трудно получить в большем количестве и биопсия тканей не требуется. Лейкемия является исключение, где достаточное количество лейкозных клеток могут быть изолированы от костного мозга. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции лейкозных клеток из костного мозга пациентов лейкемии и последующего анализа их метаболического состояния с использованием анализатора внеклеточного потока. Лейкозных клеток, изолируются градиент плотности, которая не влияет на их жизнеспособность. Следующий шаг культивирования помогает им восстанавливать, таким образом измеряется метаболических государство является состояние клеток в оптимальных условиях. Этот протокол позволяет добиться последовательного, хорошо стандартизованных результатов, которые могут быть использованы для персонализированной терапии.
Introduction
Метаболические профиль является одной из основных характеристик клеток и изменены биоэнергетики сейчас считаются одним из отличительных признаков рака1,2,3. Кроме того изменения в метаболические установки может использоваться в лечении рака ориентации сигнальных путей или ферментативный машины раковых клеток4,5,6. Зная метаболических предрасположенность раковых клеток таким образом преимущество и может помочь улучшить текущий терапии.
Существует большое количество уже установленных методов, которые можно оценить метаболическую активность клеток в культуре. Что касается гликолиза, поглощение глюкозы может быть измерено радиоактивных маркировки, с использованием 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) или внеклеточная лактат уровнях измеряется ферментативно7,8. Скорость окисления жирных кислот — еще один метаболических параметр измеряется гетерогенны помечены пальмитата9,10. Скорость потребления кислорода — это метод, широко используется для определения митохондриальной активности клеток11,12, вместе с митохондриальной мембраны потенциал оценки13,14, СПС/ADP (аденозин 5 ′ трифосфата/5′ аденозиндифосфат) соотношение измерения15 или полная внутриклеточных СПС измерения16. Сигнальные пути, известный регулировать обменные процессы может определяться белок количественной и может улучшить понимание метаболических измерения17,18,19.
Однако все эти методы измерения только один, или в лучший сценарий, несколько метаболических параметров в одном образец одновременно. Важно отметить, что одновременное измерение скорости потребления кислорода (OCR) и внеклеточной подкисления (ECAR) может быть достигнуто путем анализа внеклеточного потока анализатором, например, морской конек XFp. OCR является показателем митохондриальное дыхание и ECAR является главным образом результатом гликолиз (мы не можем игнорировать CO2 производства возможно подъемные ECAR клеток с высоким Оксидативное фосфорилирование активности)20. До настоящего времени были изучены различные типы клеток с помощью этих анализаторов21,,2223.
Здесь мы описываем протокол для анализа внеклеточного поток первичного взрывов (лейкозных клеток, полученных от стадии незрелых гемопоэтических) от больных лейкемией. В меру наших знаний отдельный протокол для первичного взрывов пока недоступна.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанные выше протокол позволяет для измерения метаболической активности, оцениваются значения OCR и ECAR в первичной лейкозных взрывов, полученных от пациентов с острым лимфобластным лейкозом (все) или острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Преимуществом измерений с помощью анализатора внекл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Чешской центров детской гематологии. Эта работа была поддерживается грант Министерства здравоохранения (NV15-28848A), министерством здравоохранения, Чешская Республика, Университет больница Мотол, Прага, Чешская Республика 00064203 и министерства образования, молодежи и спорта НПУ nr. LO1604.
Materials
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
References
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
- Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
- Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
- Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer’s Achilles’ Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
- Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
- Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
- Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
- Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
- Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
- Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
- Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
- Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
- Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).
- Lee, K. -. H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
- Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
- Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
- Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
- Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
- Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
- Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
