تقييم الأيضية للخلايا اللوكيميا الرئيسية
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لعزل الخلايا ليوكيميك من نخاع العظام في مرضى سرطان الدم وتحليل لدولته الأيضية. تقييم الشخصية الأيضية لخلايا سرطان الدم الأولية يمكن أن تساعد على أفضل وصف طلب الخلايا الأولية ويمكن أن تؤدي إلى الطب أكثر تخصيصاً.
Abstract
شرط الأيضية للخلايا السرطانية يمكن أن تؤثر سلبا على فعالية العلاج والبقاء على قيد الحياة. في الوقت الحاضر، يتم اختبار الصيدلية استهداف الأيضية في أنواع عديدة من الأورام. وهكذا، وصف سرطان الخلية الأيضي الإعداد أمر لا مفر منه بغية استهداف المسار الصحيح لتحسين الحصيلة العامة للمرضى. ولسوء الحظ، في معظم حالات السرطان، الخلايا الخبيثة يصعب جداً الحصول على أرقام أعلى وخزعة النسيج مطلوب. سرطان الدم استثناء، حيث يمكن أن يكون عدد كاف من الخلايا ليوكيميك المعزولة من نخاع العظام. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل الخلايا ليوكيميك من نخاع العظام في مرضى سرطان الدم والتحليل اللاحق لدولته الأيضية استخدام محلل الجريان خارج الخلية. يتم عزل الخلايا ليوكيميك بالتدرج الكثافة، التي لا تؤثر على قدرتها على البقاء. الخطوة زراعة يساعدهم على تجديد، وبالتالي فالدولة الأيضية قياس حالة الخلايا في ظروف مثلى. يسمح هذا البروتوكول لتحقيق نتائج متسقة وموحدة جيدا، والتي يمكن أن تستخدم لعلاج شخصية.
Introduction
التشكيل الجانبي الأيض واحدة من الخصائص الرئيسية للخلايا والاستقلاب غيرت تعتبر الآن واحدة من السمات المميزة للسرطان1،،من23. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام التغييرات في إعداد التمثيل الغذائي في علاج السرطان باستهداف ممرات توصيل الإشارات أو الآلات الانزيمية من سرطان خلايا4،،من56. مع العلم نزعة الأيضية للخلايا السرطانية وبالتالي هي ميزة ويمكن أن تساعد في تحسين العلاج الحالي.
وهناك ير طرق القائمة بالفعل التي يمكن تقييم النشاط الأيضي للخلايا في الثقافة. فيما يتعلق بتحلل، امتصاص الجلوكوز يمكن أن تقاس بوصفها المشعة، باستخدام 2-نبدج (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) أو مستويات لاكتات خارج الخلية تقاس انزيماتيكالي7،8. معدل أكسدة الأحماض الدهنية معلمة الأيضية أخرى تقاس بنظير المسمى بالميتاتي،من910. معدل استهلاك الأكسجين أسلوب يستخدم على نطاق واسع لتحديد النشاط الميتوكوندريا في الخلايا11،12، جنبا إلى جنب مع غشاء الميتوكوندريا المحتملة التقييم13،14، (الادينوسين ATP/ADP 5 ‘5’-ثلاثي/الادينوسين-diphosphate) نسبة قياس15 أو مجموعة داخل الخلية ATP قياس16. إشارات المسارات المعروفة لتنظيم عمليات التمثيل الغذائي يمكن أن تحددها كوانتيفيكيشنز البروتين ويمكن تحسين فهم القياسات الأيضية17،،من18إلى19.
بيد أن جميع هذه الأساليب قياس واحد فقط، أو في أفضل سيناريو، عدد قليل من المعالم الأيضي في إحدى عينة في وقت واحد. الأهم من ذلك، يمكن قياس المتزامن لمعدل استهلاك الأوكسجين (OCR) ومعدل تحمض خارج الخلية (أكار) بتحليل الجريان خارج الخلية، على سبيل المثال، “فرس البحر XFp محلل”. التعرف الضوئي على الحروف مؤشر على التنفس المتقدرية وعكر هو أساسا نتيجة لتحلل (لا يمكن أن نتجاهل CO2 الإنتاج ربما رفع عكر الخلايا مع النشاط الفسفرة عالية)20. حتى الآن، وقد درسنا مختلف أنواع الخلايا استخدام هذه المحلﻻت21،،من2223.
هنا نحن تصف البروتوكول لتحليل تدفق خارج الخلية من الانفجارات الأولية (خلايا اللوكيميا المستمدة من المرحلة غير ناضجة المكونة للدم) من مرضى اللوكيميا. أفضل معرفتنا، بروتوكول معين للانفجارات الأولية ليست متاحة بعد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح البروتوكول المذكور أعلاه لقياس النشاط الأيضي المقررة حسب القيم التعرف الضوئي على الحروف وعكر في انفجارات ليوكيميك الأولية المستمدة من المرضى المصابين بسرطان الدم الليمفاوي الحاد (الكل) أو سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال). ميزة قياس استخدام محلل الجريان خارج الخلية أنه ي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر مراكز أمراض الدم طب الأطفال التشيكية. وكان هذا العمل يدعم “منحة من وزارة الصحة” (NV15-28848A)، حسب وزارة الصحة في الجمهورية التشيكية، و “جامعة مستشفى موتول”، براغ، الجمهورية التشيكية 00064203 ووزارة التربية والتعليم والشباب و “الرياضة نبو” nr. LO1604.
Materials
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
References
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
- Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
- Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
- Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer’s Achilles’ Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
- Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
- Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
- Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
- Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
- Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
- Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
- Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
- Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
- Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).
- Lee, K. -. H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
- Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
- Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
- Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
- Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
- Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
- Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
