Evaluación del perfil metabólico de las células leucémicas primarias
Summary
Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de las células leucémicas de pacientes de leucemia la médula ósea y análisis de su estado metabólico. Evaluación del perfil metabólico de las células leucémicas primarias podría ayudar a caracterizar mejor la demanda de células primarias y podría conducir a la medicina más personalizada.
Abstract
El requerimiento metabólico de las células cancerosas puede influir negativamente la supervivencia y la eficacia del tratamiento. En la actualidad, dirigidos a farmacéuticos de vías metabólicas se prueban en muchos tipos de tumores. Así, caracterización de configuración metabólica de célula de cáncer es inevitable con el fin de orientar el camino correcto para mejorar el resultado global de los pacientes. Lamentablemente, en la mayoría de los cánceres, las células malignas son muy difíciles de obtener en números más altos y se requiere la biopsia de tejido. La leucemia es una excepción, donde un número suficiente de células leucémicas puede ser aislado de la médula ósea. Presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de las células leucémicas de pacientes de leucemia la médula ósea y posterior análisis de su estado metabólico utilizando analizador de flujo extracelular. Las células leucémicas están aisladas por gradiente de densidad, que no afecta su viabilidad. El siguiente paso de cultivo ayuda a regenerar, por lo tanto el estado metabólico medido es el estado de las células en óptimas condiciones. Este protocolo permite obtener resultados consistentes y bien estandarizados, que podrían ser utilizados para la terapia personalizada.
Introduction
El perfil metabólico es una de las principales características de las células y alteración bioenergética se consideran uno de los sellos del cáncer1,2,3. Además, cambios en la configuración de metabólica podrían utilizarse en el tratamiento del cáncer, dirigiéndose a vías de transducción de señal o maquinaria enzimática de las células de cáncer4,5,6. Sabiendo la predisposición metabólica de las células cancerosas es una ventaja y puede ayudar a mejorar la terapia actual.
Hay un montón de métodos ya establecidos que puede evaluar la actividad metabólica de las células en cultivo. Con respecto a la glucólisis, la captación de glucosa puede medirse mediante el etiquetado radiactivo, utilizando 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) o niveles de lactato extracelular medición enzimáticamente7,8. Tasa de oxidación de ácidos grasos es otro parámetro metabólico medido por palmitato marcado isotópicamente9,10. Tasa de consumo de oxígeno es un método ampliamente utilizado para la determinación de la actividad mitocondrial en células11,12, junto con la membrana mitocondrial potencial evaluación13,14, ATP/ADP (adenosina 5-difosfato de adenosina-trifosfato/5′) relación medida15 o total intracelular ATP medida16. Vías que regulan procesos metabólicos de señalización podría ser determinado por cuantificaciones de proteína y puede mejorar la comprensión de las mediciones metabólicas17,18,19.
Sin embargo, todos estos métodos de medir sólo uno o, en el mejor escenario, algunos parámetros metabólicos en una muestra al mismo tiempo. Lo importante, medición simultánea de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) puede lograrse mediante el análisis de flujo extracelular por, por ejemplo, analizador de XFp de Caballito de mar. OCR es un indicador de la respiración mitocondrial y ECAR es principalmente el resultado de la glicolisis (que no podemos ignorar la producción de CO2 elevar posiblemente ECAR de células con actividad de fosforilación oxidativa alta)20. Hasta ahora, se han estudiado diversos tipos celulares usando estos analizadores21,22,23.
Aquí describimos el protocolo para el análisis de flujo extracelular de primarias blastos (células de leucemia derivadas de la etapa hematopoyética inmadura) de pacientes con leucemia. A lo mejor de nuestro conocimiento, un protocolo específico para ráfagas primarios no está disponible todavía.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo anteriormente descrito permite la medición de la actividad metabólica determinada por valores de OCR y ECAR en ráfagas leucémicas primarias derivadas de pacientes con leucemia linfoblástica aguda (LLA) o leucemia mieloide aguda (AML). La ventaja de la medida usando un analizador de flujo extracelular es que permite la detección de perfil metabólico en el tiempo real en las células vivas. Esencialmente, cada paso en el protocolo proporcionado podría ajustarse dependiendo del tipo de célula se planea…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a los centros de hematología pediátrica Checa. Este trabajo fue apoyado por la beca del Ministerio de salud (NV15-28848A), Ministerio de salud de la Universidad Hospital Motol, República Checa, Praga, República Checa 00064203 y por el Ministerio de educación, juventud y deportes NPU y nr. LO1604.
Materials
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
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