Vurdering af primære leukæmiceller metaboliske profil
Summary
Her præsenterer vi en protokol til isolering af leukemic celler fra leukæmi patienter knoglemarven og analyse af deres metabolisk tilstand. Vurdering af den metaboliske profil af primære leukæmiceller kan hjælpe til bedre karakterisere efterspørgsel af primærelementer og kan føre op til mere personlig medicin.
Abstract
De metaboliske krav af kræftceller kan negativt påvirke overlevelse og behandling virkning. I dag, er farmaceutiske målretning af stofskifteveje testet i mange typer af tumorer. Karakterisering af kræft celle metaboliske setup er således uundgåeligt for at målrette den rigtige vej for at forbedre det samlede resultat af patienter. Desværre, i en de fleste kræftformer, de maligne celler er ganske vanskeligt at opnå i højere numre og væv biopsi er nødvendig. Leukæmi er en undtagelse, hvor et tilstrækkeligt antal leukemic celler kan isoleres fra knoglemarven. Her give vi en detaljeret protokol for isolering af leukemic celler fra leukæmi patienter knoglemarven og efterfølgende analyse af deres metaboliske tilstand ved hjælp af ekstracellulære flux analyzer. Leukemic celler er isoleret af tæthed farveforløb, som ikke påvirker deres levedygtighed. Det næste skridt i dyrkning hjælper dem til at regenerere, således den metaboliske stat målt er de celler i optimale betingelser. Denne protokol giver mulighed for at opnå konsistente, godt standardiserede resultater, som kunne bruges til den personlige terapi.
Introduction
Den metaboliske profil er et af de vigtigste kendetegn for celler og ændrede bioenergetik er nu betragtes som en af kendetegnene ved kræft1,2,3. Derudover kunne ændringer i opsætningen af metaboliske bruges i behandling af kræft ved at målrette signaltransduktionsveje eller enzymatisk maskiner af kræft celler4,5,6. At kende den metaboliske disposition af kræftceller er således en fordel og kan hjælpe med at forbedre den nuværende terapi.
Der er masser af allerede etablerede metoder, som kan vurdere den metaboliske aktivitet af celler i kultur. Vedrørende glykolyse, glukoseoptagelse kan måles af den radioaktive mærkning, ved hjælp af 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) eller ekstracellulære laktat niveauer målt enzymatisk7,8. Fedtsyre oxidation sats er en anden metabolisk parameter målt ved brændselsfremstilling navngivet palmitat9,10. Ilt forbrugssats er en metode, der er almindeligt anvendt til bestemmelse af mitokondrie-aktivitet i cellerne11,12, sammen med den mitokondrielle membran potentielle evaluering13,14, ATP/ADP (adenosin 5 ‘-trifosfat/adenosin 5 ‘-ud) forholdet måling15 eller total intracellulære ATP måling16. Signalering veje kendt for at regulere metaboliske processer kunne bestemmes af protein kvantificeringer og kan forbedre forståelsen af metaboliske målinger17,18,19.
Men alle disse metoder måler kun én, eller i bedste fald et par metaboliske parametre i en prøve samtidigt. Vigtigere, kan samtidig måling af ilt forbrugssats (OCR) og ekstracellulære forsuring sats (ECAR) opnås ved den ekstracellulære flux analyse af, for eksempel, Seahorse XFp Analyzer. OCR er en indikator for mitokondrie respiration og ECAR er primært et resultat af glykolyse (vi ikke kan ignorere CO2 produktion eventuelt opløftende ECAR af celler med højt oxidativ fosforylering aktivitet)20. Hidtil har er forskellige celletyper blevet studeret ved hjælp af disse analysatorer21,22,23.
Her beskriver vi i protokollen for den ekstracellulære flux analyse af primære Blaster (leukæmiceller, der stammer fra den umodne hæmatopoietisk fase) fra leukæmi patienter. Til bedste af vores viden er en særlig protokol for primære eksplosionerne ikke tilgængelig endnu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ovenfor beskrevne protokol giver mulighed for måling af den metaboliske aktivitet vurderet af OCR og ECAR værdier i primær leukemic eksplosionerne afledt af patienter med akut lymfoblastær leukæmi (alle) eller akut myeloid leukæmi (AML). Fordelen ved måling ved hjælp af en ekstracellulære flux analyzer er, at det giver mulighed for påvisning af metaboliske profil i realtid i de levende celler. Det væsentlige, hvert trin i den angivne protokol kunne justeres afhængigt af hvilken celle en planer om at stude…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke den tjekkiske Pediatric hæmatologi Centre. Dette arbejde blev støttet af tilskud af Ministeriet for sundhed (NV15-28848A), af Sundhedsministeriet i Tjekkiet, University Hospital Motol, Prag, Tjekkiet 00064203 og af Ministeriet for uddannelse, Ungdom og sport NPU nr. LO1604.
Materials
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
References
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
- Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
- Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
- Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer’s Achilles’ Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
- Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
- Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
- Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
- Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
- Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
- Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
- Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
- Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
- Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).
- Lee, K. -. H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
- Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
- Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
- Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
- Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
- Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
- Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
