Her presenterer vi en protokoll for isolering av leukemic celler fra leukemi pasienter benmargen og analyse av deres metabolske tilstand. Vurdering av metabolske profilen til primære leukemi celler kan bidra til å bedre karakterisere etterspørselen av primære celler og føre til mer personlig medisin.
Metabolske behovet av kreftceller kan negativt påvirke overlevelse og behandling effekt. I dag, er farmasøytiske målretting av metabolske veier testet i mange typer av svulst. Dermed er karakteristikk av kreft cellen metabolske oppsett uunngåelig for å målrette den riktige veien for å øke det samlede resultatet av pasienter. Dessverre, i de fleste av kreft, ondartet cellene er ganske vanskelig å få tak i høyere tall og vev biopsi er nødvendig. Leukemi er et unntak, der et tilstrekkelig antall leukemic celler kan isoleres fra benmargen. Her gir vi en detaljert protokoll for isolering av leukemic celler fra leukemi pasienter benmargen og påfølgende analyse av sine metabolske staten ved hjelp av ekstracellulære flux analyzer. Leukemic celler er isolert av tetthet gradient, hvilke ikke påvirker sin levedyktighet. Neste dyrking trinn hjelper dem å regenerere, dermed metabolske staten målt er celler under optimale forhold. Denne protokollen tillater å oppnå konsistente, godt standardisert resultater, som kan brukes for personlig terapi.
Metabolsk profilen er en av de viktigste egenskapene av celler og endret bioenergi er nå regnet som en av kjennetegnene kreft1,2,3. Videre kan endringer i metabolske oppsettet brukes i behandling av kreft ved å målrette signaltransduksjon trasé eller enzymatisk maskiner kreft celler4,5,6. Å vite den metabolske predisposisjon av kreftceller er således en fordel og kan forbedre gjeldende terapi.
Det er en masse allerede etablerte metoder som kan vurdere metabolske aktiviteten til cellene i kultur. Om Glykolysen, glukose opptak kan måles ved radioaktivt merkingen, med 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) eller ekstracellulær laktat nivåer målt enzymatisk7,8. Fettsyrer er oksidasjon en annen metabolske parameter målt ved isotopically merket palmitate9,10. Oksygen forbruksraten er en metode mye brukt for å bestemme mitokondrie aktivitet i cellene11,12, sammen med de mitokondrie membran potensielle evaluering13,14, ATP/ADP (adenosin 5 ‘-trifosfat/5 ‘-adenosindifosfat) forholdet måling15 eller totalt intracellulær ATP måling16. Signalnettverk trasé kjent for å regulere metabolske prosesser kan bestemmes av protein quantifications og kan forbedre forståelsen av metabolske målinger17,18,19.
Men alle disse metodene mål bare ett, eller inne det best filmmanuskriptet, noen metabolske parametere i en prøve samtidig. Viktigere, kan samtidig måling av oksygen forbruksraten (OCR) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR) oppnås ved ekstracellulære flux analysen av, for eksempel Seahorse XFp Analyzer. OCR er en indikator på mitokondrie åndedrett og ECAR skyldes hovedsakelig Glykolysen (vi ikke kan overse CO2 produksjon muligens heve ECAR celler med høy oxidative fosforylering aktivitet)20. Så langt, har ulike celletyper studert ved bruk av disse analyserer21,22,23.
Her beskriver vi protokollen for ekstracellulære flux analyse av primære eksplosjonene (leukemi celler avledet fra umodne blodkreft scenen) fra leukemi pasienter. Best av vår kunnskap er en bestemt protokoll for primære eksplosjonene ikke tilgjengelig ennå.
Ovenfor beskrevet protokollen tillater for måling av metabolske aktiviteten vurdert av OCR og ECAR verdier i primære leukemic støt fra pasienter med akutt lymfatisk leukemi (alle) eller akutt myelogen leukemi (AML). Fordelen med måling ved hjelp av en ekstracellulære flux analyserer er at den lar påvisning av metabolske profil i sanntid i live cellene. Hovedsak kan alle trinn i angitte protokollen justeres avhengig celle man planlegger å studere. Her vil vi diskutere de viktigste parameterne som kan påvirke resul…
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke den tsjekkiske Pediatric hematologi sentre. Dette arbeidet var støttet av Grant av Helsedepartementet (NV15-28848A), av Helsedepartementet av Tsjekkia, University Hospital Motol, Prague, Tsjekkia 00064203 og departementet for utdanning, ungdom og sport NPU jeg nr. LO1604.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |