תאים מיאלואידים מולדת איתות לשביל רגולציה על-ידי פעילות Paracaspase MALT1
Summary
MALT1 מסדיר מולדת חסינות אך איך זה מתרחש נשאר מעורפל. השתמשנו החומר המדכא paracaspase סלקטיבית MALT1 הטכנולוגי-827 לפענח את התרומה של MALT1 איתות מולדת במורד הזרם של קולטני לקטין דמוי כמו אגרה או C-type, הוכחת MALT1 מסדיר את הייצור של תאים מיאלואידים ציטוקינים, ויוצאת של קולטני לקטין דמוי C-type, באופן סלקטיבי.
Abstract
מלבד תפקודו בתאים הלימפה, אשר טופלה על ידי מחקרים רבים, paracaspase MALT1 גם ממלא תפקיד חשוב בתאים מולדת במורד הזרם של קולטני זיהוי דפוס. למד בצורה הטובה ביותר הם בני Dectin-1 ו- Dectin-2 של משפחת לקטין דמוי קולטן מסוג C זה לגרום SYK CARD9 ותלוי איתות אשד שמוביל NF-κB ההפעלה, באופן תלוי-MALT1. לעומת זאת, כמו אגרה קולטנים (TLR), כגון TLR-4, הפצת NF-κB הפעלה אבל אות דרך המפל MYD88/שמסכנים-תלוי. בכל זאת, MALT1 עשוי לתרום TLR-4 איתות נשאר לא ברור. הראיות זה התבצעה עם המכון הטכנולוגי-827, מעכב חזק, סלקטיבי של פעילות paracaspase MALT1, מציין כי TNF-ייצור במורד הזרם של TLR-4 בתאי מיאלואידית אדם אינו תלוי MALT1, בניגוד TNF-הייצור במורד הזרם של Dectin-1, אשר הוא MALT1 התלויים. כאן, אנחנו פתרנו את מעורבות סלקטיבי של MALT1 זיהוי תבניות חישה עוד יותר, באמצעות מגוון של האדם ואת ההכנות הסלולר העכבר גירוי של Dectin-1, MINCLE או TLR-4 מסלולים. אנחנו גם מספק תובנות נוספות על-ידי חקר ציטוקינים מעבר TNF- ולאחר השוואת הטכנולוגי-827 מעכב SYK (Cpd11), מעכב IKK (AFN700). באופן קולקטיבי, הנתונים שנמסרו ראיות נוספות עבור MALT1-התלות של קולטן דמוי לקטין C-type – איתות לעומת זאת כדי TLR איתות.
Introduction
הפעילות paracaspase של MALT1 (רירית הקשורים רקמת הלימפה לימפומה רוברטסונית חלבון 1) התגלה ב 20081,2. מאז, מספר מחקרים דיווחו על תרומתה קריטי אנטיגן קולטן תגובות לימפוציטים. דגמים גנטיים העכבר כמו גם נתונים פרמקולוגיה תמיכה תפקיד מפתח בתאי T, T-cell התלויים מחלת חיסון עצמי, B-cell לימפומה הגדרות3,4. לימפוציטים, הפעלת paracaspase MALT1 חל על הרכבה של CARD11-BCL10-MALT1 מורכבים5, אשר מופעלת על ידי אנטיגן קולטן proximal איתות במורד הזרם של הקולטן T – או B-cell. יש גם ראיות המלמדות כי מתחם CARD9-BCL10-MALT1 דומה חשוב להפצת אותות במורד הזרם של קולטני לקטין דמוי C-type (הר ר), למשל, Dectin-1, Dectin-2 ו- MINCLE ב מיאלואידית תאים6,7. Dectin-1 נחקרה היטב כי מסלול זה הוא קריטי עבור המארח הגנה מפני זיהומים פטרייתיים8,9. המשמעות של MALT1 במשעולים קולטן דמוי-אגרה (TLR), עם זאת, נותרה במחלוקת10. הראיות זה התבצעה בתאי מיאלואידית אדם לשלול תפקיד ישיר לפעילות paracaspase MALT1 בוויסות של TNF-ייצור במורד הזרם של TLR-411.
בשנת העבודה הנוכחית, השתמשנו שונים הגדרות ניסיוני מופחתים בן אנוש וכל התנאים התאים מיאלואידית העכבר כדי לחקור מולדת איתות המסלולים, להסתמך על כלי תרופתי מסוים מעכבי ומדידה של ייצור ציטוקינים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה זו, היינו הגדרות ניסיוני פשוטה ללמוד איתות המסלולים-אנוש ותאים מולדת העכבר, ולחקור את התלות פונקציית הפרוטאוליטי MALT1. הרחבת העבודה הקודמת11, המחקר שלנו הראה כי MALT1 paracaspase פעילות פקדי C-type קולטן דמוי לקטין בהשפעת ציטוקינים הייצור, כולל TNF-α. לעומת זאת, TNF-α TLR-4-induced היה עצמאי ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Elsevier לאישור שלהם (רשיון מס ‘ 4334770630127) להתרבות כאן איור 2A מ. Unterreiner et al. (2017).
Materials
| 100 µm nylon cell strainer | Sigma | CLS431752 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352057 | |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352090 | |
| 50 mL Falcon tube | Falcon | 352070 | |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid | Costar | 3595 | |
| 96 well V-bottom plate | Costar | 734-1798 | |
| Ammonium Chloride – NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Assay diluent RD1-W ELISA | R&D | 895038 | Assay diluent |
| Cell culture microplate, 384 well, black | Greiner | 781986 | |
| Depleted Zymosan | Invivogen | tlrl-dzn | now: tlrl-zyd |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO |
| EDTA-Na2 | Sigma | E5134 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate |
| ELISA muTNF-α | R&D | SMTA00 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| GM-CSF | Novartis | – | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | FBS |
| HTRF hu IL-23 | CisBio | 62HIL23PEG | |
| HTRF hu TNF-α | CisBio | 62TNFPEC | |
| HTRF reconstitution buffer | CisBio | 62RB3RDE | 50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA |
| IFN-γ | R&D | L4516 | |
| IL-4 | Novartis | – | |
| Isoflurane | Abbott | Forene | |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma | L4391 | LPS used in human samples |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516 | LPS used in murine samples |
| Lysis buffer | Self-made | – | 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Magnet | Stemcell | 18001 | |
| Microplate, 384 well white | Greiner | 784075 | |
| Monocytes enrichment kit | Stemcell | 19059 | |
| Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 °C Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | cooling device (containing Propanol-2) |
| PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2 | Gibco | 10010 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Pen/Strep |
| Potassium bicarbonate – KHCO3 | Sigma | P9144 | |
| PrestoBlue | Invitrogen | A13262 | Resazurin solution for viability assessment |
| Propanol-2 | Merck | 1.09634 | |
| Read buffer | MesoScale Discovery | R92TC-3 | Tris-based buffer containing tripropylamine |
| Recovery cell culture freezing medium | Gibco | 12648-010 | freezing medium |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax | Gibco | 61870 | + 10% FBS for iMoDCs + 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes + 10% FBS + Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for murine splenocytes |
| Separation buffer | Self-made | – | PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Trehalose-6,6-dibehenate | Invivogen | tlrl-tdb | TDB |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | Polysorbate 20 |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15675 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Viewseal sealer | Greiner BioOne | 676070 | |
| V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit | MesoScale Discovery | K15049D | electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8) |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350 |
References
- Coornaert, B., et al. T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20. Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).
- Rebeaud, F., et al. The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).
- Jaworski, M., Thome, M. The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).
- Meininger, I., Krappmann, D. Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome. Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).
- Qiao, Q., et al. Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly. Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).
- Gross, O., et al. Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity. Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).
- Chiffoleau, E. C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets. Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Taylor, P. R., et al. Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection. Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).
- Lanternier, F., et al. Primary immunodeficiencies underlying fungal infections. Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).
- Thome, M. Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation. Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).
- Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-α production downstream of TLR-4 in myeloid cells. Immunology Letters. , 48-51 (2017).
- Strasser, D., et al. Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-δ to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity. Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).
- Jaworski, M., et al. Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity. The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).
- Yu, J. W., et al. MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses. PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).
- Bardet, M., et al. The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition. Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).
- Thoma, G., et al. Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).
- Bauer, B., Steinle, A. HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch. Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).
- Gringhuis, S. I., et al. Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2. PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).
- Dufner, A., Schamel, W. W. B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model. Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6 (2011).
- Phelan, J. D., et al. A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma. Nature. , (2018).
