Summary

palt1 副酶活性对髓系先天信号通路的调控

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

alt1 调节先天免疫, 但这种情况是如何发生的仍未确定。我们使用选择性 malt1 副囊酶抑制剂 mlt-827 来解开 malt1 对 toll 样或 c 型凝集素受体下游的先天信号的贡献, 证明 malt1 调节骨髓细胞因子的产生, 并在下游c 型乳素样受体, 选择性的。

Abstract

除了在淋巴细胞中的功能外, 还有许多研究都涉及到它的功能, 副胸酶 kalt1 在模式识别受体下游的先天细胞中也发挥着重要作用。最好的研究是 c 型乳素样受体家族的 dectin-1 和 dectin-2 成员, 它们以与 alt1 相关的方式诱导 syk 和 card9 依赖信号级联, 从而导致 nf-b 激活。相比之下, toll 样受体 (tlr), 如 tlr-4, 传播 nf-b 激活, 但通过 myd88/依赖 irak 级联发出信号。尽管如此, alt1 是否可能对 tlr-4 信号做出贡献仍不清楚。作为对 falt1 副酶活性的有效和选择性抑制剂, mlt-827 的最新证据表明, 人骨髓细胞中的 tnf-ptr-4 生产与 falt1 的下游无关, 而不是 ttint-1 下游的 tnf 生产, 而 ttint-1 是丙种细胞。依赖。在这里, 我们讨论了 alt1 在模式识别传感中的选择性参与, 进一步使用了各种人和小鼠的细胞制剂, 并刺激了十丁-1、mincle 或 tlr-4 途径。我们还通过探索 tnf 之外的细胞因子, 并将 mlt-827 与 syk 抑制剂 (cpd11) 和 ikk 抑制剂 (afn700) 进行比较, 提供了更多的见解。总体而言, 这些数据为 c 型乳素样受体的 alt1 依赖性提供了进一步的证据–与 tlr 信号相比, 信号传递。

Introduction

2008年1,2 例发现了菌核相关淋巴组织淋巴瘤移位蛋白 1) 的副适应酶活性。自那时以来, 一些研究报告了它对淋巴细胞抗原受体反应的重要贡献。小鼠遗传模型以及药理数据支持 t 细胞、t 细胞依赖性自身免疫和 b 细胞淋巴瘤设置3,4的关键作用。在淋巴细胞中, 在标记11-bcl10-alt1 复合物5的组装时, 会发生 alt1 副酶激活, 这是由 t-或 b 细胞受体下游的抗原受体近端信号触发的。还有充分的证据表明, 类似的 card9-bcl10-大力图1复合物对于在骨髓细胞 6,7 中传播 c 型乳素样受体 (cllr) 下游的信号非常重要, 例如, 丁-1、十丁-2 和 mincle。十分蛋白-1 已得到特别好的研究, 因为这种途径是关键的主机防御真菌感染 8,9。然而, 在 toll 样受体 (tlr) 通路中, alt1 的含义仍有争议10。最近在人类骨髓细胞中的证据排除了 alt1 副酶活性在 tlr-411 下游tnf-生产监管中的直接作用。

在本工作中, 我们利用人类和小鼠骨髓细胞的各种实验设置和刺激条件, 利用特定的药理工具抑制剂和细胞因子产生的测量, 探索先天信号通路。

Protocol

实验是根据诺华人类研究伦理委员会的准则和标准进行的。 1. 用人药布制备外周血单个核细胞 (pbmc) 请注意:我们在收集了50毫升的袋子里, 从健康的志愿者那里收到了一件蓬松的外套。它们是在知情同意的情况下提供的, 并通过区域间 blutspende schweizeriches rotes kreuz 收集的。除非另有说明, 否则我们在室温下使用以下程序处理这些问题。 …

Representative Results

在骨髓细胞中, alt1 将激活信号传递到几种 c 型乳素样受体的下游, 如十氯化锡-1、十丁-2 和 mincle6。这些途径依赖于 (下摆) 含 itam 图案的受体 (例如, dectin-1) 或含有 itam 的共同受体 (例如, fcrγ, 用于 Dectin-1 和 mincle), 用于招募和激活 sykinase (图 1)。这导致激活蛋白激酶 c 等形, 即 pkc, 磷酸化 card9, 从而触发 card9/bcl/alt1 复合?…

Discussion

在这项工作中, 我们使用简单的实验设置来研究人和小鼠先天细胞的信号通路, 并询问他们对 alt1 蛋白溶解功能的依赖。在先前工作11的基础上, 我们的研究表明, alt1 副酶活性控制 c 型肌肽样受体诱导的细胞因子的产生, 包括 tnf-α。相反, tlr-4 诱导的 tnf-α在这两个物种中都与 alt1 无关。这些数据总体上证实了 c 型乳素样受体下游的 m异位谱的关键和选择性贡献, 早期的研究<sup class="…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢 elsevier 授权 (许可证编号 4334770630127) 在这里复制来自 unterreiner等人的图 2a 。(2017年)。

Materials

100 µm nylon cell strainer Sigma CLS431752
14 ml Falcon tube BD Falcon 352057
15 mL Falcon tube Falcon 352090
50 mL Falcon tube Falcon 352070
6 well plates Costar 3516
96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid Costar 3595
96 well V-bottom plate Costar 734-1798
Ammonium Chloride – NH4Cl Sigma A9434
Assay diluent RD1-W ELISA R&D 895038 Assay diluent
Cell culture microplate, 384 well, black Greiner 781986
Depleted Zymosan Invivogen tlrl-dzn now: tlrl-zyd
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650 DMSO
EDTA-Na2 Sigma E5134 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate
ELISA muTNF-α R&D SMTA00
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03
gentleMACS C tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
GM-CSF Novartis
Heat-inactivated Fetal bovine serum Gibco 10082 FBS
HTRF hu IL-23 CisBio 62HIL23PEG
HTRF hu TNF-α CisBio 62TNFPEC
HTRF reconstitution buffer CisBio 62RB3RDE 50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA
IFN-γ R&D L4516
IL-4 Novartis
Isoflurane Abbott Forene
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma L4391 LPS used in human samples
Lipopolysaccharides Sigma L4516 LPS used in murine samples
Lysis buffer Self-made 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4
Magnet Stemcell 18001
Microplate, 384 well white Greiner 784075
Monocytes enrichment kit Stemcell 19059
Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 °C Freezing Container Nalgene 5100-0001 cooling device (containing Propanol-2)
PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2 Gibco 10010 Phosphate-buffered saline
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 Pen/Strep
Potassium bicarbonate – KHCO3 Sigma P9144
PrestoBlue Invitrogen A13262 Resazurin solution for viability assessment
Propanol-2 Merck 1.09634
Read buffer MesoScale Discovery R92TC-3 Tris-based buffer containing tripropylamine
Recovery cell culture freezing medium Gibco 12648-010 freezing medium
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax Gibco 61870 + 10% FBS for iMoDCs
+ 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes
+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for murine splenocytes
Separation buffer Self-made PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0
Sodium Pyruvate Gibco 11360
Trehalose-6,6-dibehenate Invivogen tlrl-tdb TDB
Tween 20 Sigma P7949 Polysorbate 20
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen 15675 Ethylenediaminetetraacetic acid
Viewseal sealer Greiner BioOne 676070
V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit MesoScale Discovery K15049D electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8)
β-Mercaptoethanol Gibco 31350

References

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Unterreiner, A., Touil, R., Anastasi, D., Dubois, N., Niwa, S., Calzascia, T., Bornancin, F. Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity. J. Vis. Exp. (143), e58439, doi:10.3791/58439 (2019).

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