Mieloide inata sinalização via regulamento por MALT1 Paracaspase atividade
Summary
MALT1 regula a imunidade inata, mas como isso ocorre permanece indefinida. Usamos o inibidor seletivo de paracaspase MALT1 MIT-827 para desvendar a contribuição da MALT1 para sinalização inata, a jusante dos receptores Toll-like ou tipo C do tipo lectina, demonstrando que MALT1 regula a produção de citocinas mieloides e a jusante dos receptores do tipo lectina do tipo C, seletivamente.
Abstract
Além de sua função nas células linfoides, que foi abordada por numerosos estudos, o paracaspase MALT1 também desempenha um papel importante nas células inatas a jusante dos receptores de reconhecimento padrão. Mais bem estudados são os membros da família de receptores de lectina tipo C-tipo Dectin-1 e Dectin-2 que induzem um dependente SYK – e CARD9-sinalização em cascata, levando a ativação do NF-κB, em uma maneira MALT1-dependente. Por outro lado, receptores do tipo Toll (TLR), como o TLR-4, propaga a ativação de NF-κB, mas sinal através de uma cascata de MYD88/IRAK-dependente. No entanto, se MALT1 possam contribuir para a sinalização de TLR-4 manteve-se pouco clara. Evidências recentes com MIT-827, um inibidor potente e seletivo da MALT1 paracaspase atividade, indicam que o TNF-produção a jusante de TLR-4 em células mieloides humanas é independente de MALT1, ao contrário do TNF-produção a jusante de Dectin-1, que é MALT1 dependente. Aqui, abordámos o envolvimento seletivo de MALT1 em reconhecimento de padrões, sentindo-se ainda mais, usando uma variedade de humanos e rato celular, produtos de higiene e estimulação de Dectin-1, MINCLE ou TLR-4 vias. Nós também forneceu insights adicionais explorando citocinas TNF-e comparando MIT-827 para um inibidor SYK (Cpd11) e um inibidor IKK (AFN700). Coletivamente, os dados fornecidos ainda mais evidência para a dependência de MALT1 dos receptores de lectina tipo C-tipo — sinalização em contrapartida para sinalização de TLR.
Introduction
A atividade de paracaspase de MALT1 (proteína associada a Mucosa tecido linfoide linfoma translocação 1) foi revelada em 20081,2. Desde então, vários estudos têm relatado sua contribuição fundamental para respostas de receptor do antígeno em linfócitos. Modelos genéticos no mouse, bem como dados de farmacologia suportam um papel-chave em células T, de auto-imunidade dependente de células T e células B linfoma configurações3,4. Em linfócitos, MALT1 paracaspase ativação ocorre após a montagem de um CARD11-BCL10-MALT1 complexo5, que é acionado por sinalização proximal do antigénio-receptor a jusante do receptor de células T ou B. Também há ampla evidência de que um complexo CARD9-BCL10-MALT1 semelhante é importante para a propagação de sinais a jusante dos receptores do tipo lectina tipo C (CLLR), por exemplo,, Dectin-1, Dectin-2 e MINCLE em mieloide células6,7. Dectin-1 tem sido particularmente bem estudado, pois esta via é fundamental para a defesa do hospedeiro contra infecções fúngicas8,9. Implicação de MALT1 em vias de receptores do tipo Toll (TLR), no entanto, manteve-se controversa10. Evidências recentes em células mieloides humanas descartaram um papel direto para a atividade de paracaspase MALT1 na regulação do TNF-produção a jusante de TLR-411.
No presente trabalho, costumávamos várias configurações experimentais e condições estimulatórios em humanos e pilhas myeloid rato sonda inatas vias de sinalização, baseando-se na ferramenta farmacológica específica inibidores e medição da produção de citocinas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho, usamos configurações simples experimentais para estudar a sinalização percursos em humanos e inata pilhas do rato e interrogar sua dependência na função proteolítica MALT1. Expansão no anterior trabalho11, nosso estudo mostrou que MALT1 paracaspase atividade controla tipo C lectin como receptor induzida produção de citocinas, incluindo TNF-α. Em contraste, o TLR 4-induzida por TNF-α foi independente de MALT1 em ambas as espécies. Coletivamente, estes dados corroboram …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Elsevier para sua autorização (matrícula 4334770630127) reproduzir aqui Figura 2A de Unterreiner et al . (2017).
Materials
| 100 µm nylon cell strainer | Sigma | CLS431752 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352057 | |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352090 | |
| 50 mL Falcon tube | Falcon | 352070 | |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid | Costar | 3595 | |
| 96 well V-bottom plate | Costar | 734-1798 | |
| Ammonium Chloride – NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Assay diluent RD1-W ELISA | R&D | 895038 | Assay diluent |
| Cell culture microplate, 384 well, black | Greiner | 781986 | |
| Depleted Zymosan | Invivogen | tlrl-dzn | now: tlrl-zyd |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO |
| EDTA-Na2 | Sigma | E5134 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate |
| ELISA muTNF-α | R&D | SMTA00 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| GM-CSF | Novartis | – | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | FBS |
| HTRF hu IL-23 | CisBio | 62HIL23PEG | |
| HTRF hu TNF-α | CisBio | 62TNFPEC | |
| HTRF reconstitution buffer | CisBio | 62RB3RDE | 50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA |
| IFN-γ | R&D | L4516 | |
| IL-4 | Novartis | – | |
| Isoflurane | Abbott | Forene | |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma | L4391 | LPS used in human samples |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516 | LPS used in murine samples |
| Lysis buffer | Self-made | – | 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Magnet | Stemcell | 18001 | |
| Microplate, 384 well white | Greiner | 784075 | |
| Monocytes enrichment kit | Stemcell | 19059 | |
| Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 °C Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | cooling device (containing Propanol-2) |
| PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2 | Gibco | 10010 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Pen/Strep |
| Potassium bicarbonate – KHCO3 | Sigma | P9144 | |
| PrestoBlue | Invitrogen | A13262 | Resazurin solution for viability assessment |
| Propanol-2 | Merck | 1.09634 | |
| Read buffer | MesoScale Discovery | R92TC-3 | Tris-based buffer containing tripropylamine |
| Recovery cell culture freezing medium | Gibco | 12648-010 | freezing medium |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax | Gibco | 61870 | + 10% FBS for iMoDCs + 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes + 10% FBS + Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for murine splenocytes |
| Separation buffer | Self-made | – | PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Trehalose-6,6-dibehenate | Invivogen | tlrl-tdb | TDB |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | Polysorbate 20 |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15675 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Viewseal sealer | Greiner BioOne | 676070 | |
| V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit | MesoScale Discovery | K15049D | electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8) |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350 |
References
- Coornaert, B., et al. T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20. Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).
- Rebeaud, F., et al. The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).
- Jaworski, M., Thome, M. The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).
- Meininger, I., Krappmann, D. Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome. Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).
- Qiao, Q., et al. Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly. Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).
- Gross, O., et al. Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity. Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).
- Chiffoleau, E. C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets. Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Taylor, P. R., et al. Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection. Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).
- Lanternier, F., et al. Primary immunodeficiencies underlying fungal infections. Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).
- Thome, M. Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation. Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).
- Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-α production downstream of TLR-4 in myeloid cells. Immunology Letters. , 48-51 (2017).
- Strasser, D., et al. Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-δ to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity. Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).
- Jaworski, M., et al. Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity. The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).
- Yu, J. W., et al. MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses. PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).
- Bardet, M., et al. The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition. Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).
- Thoma, G., et al. Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).
- Bauer, B., Steinle, A. HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch. Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).
- Gringhuis, S. I., et al. Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2. PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).
- Dufner, A., Schamel, W. W. B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model. Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6 (2011).
- Phelan, J. D., et al. A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma. Nature. , (2018).
